引用本文
康毓芝, 杨宝珍, 王立斌, 吴若芬, 师志云. 宁夏地区Graves'病与CTLA-4基因多态性相关性研究. 25(4): 292-295
KANG Yuzhi, YANG Baozhen, WANG Libin, WU Ruofen, SHI Zhiyun. Research on the correlation of gene polymorphism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 and Graves'disease in Ningxia. Labratory Medicine, 25(4): 292-295  
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宁夏地区Graves'病与CTLA-4基因多态性相关性研究
康毓芝1, 杨宝珍2, 王立斌2, 吴若芬2, 师志云2
1. 宁夏医科大学,宁夏 银川 750004
2. 宁夏医学院附属医院医学实验中心,宁夏 银川 750004

通讯作者：杨宝珍,联系电话：0951-6743335。

作者简介：康毓芝,女,1975年生,主管技师,主要从事分子生物学研究。

基金:宁夏教育厅资助项目(NO.2006·237)
摘要
目的

探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CLTA-4)基因多态性与宁夏人群Graves'病(GD)的相关性。

方法

应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析61例GD患者和60名对照者的CTLA-4基因第一外显子(49)A/G位点和启动子(318)C/T位点多态性。

结果

GD患者组与对照组之间CTLA-4基因SNP (49)A/G的基因型分布( χ2=9.277, P<0.05)及等位基因频率( χ2= 10.831, P<0.05)差异有统计学意义;SNP(318)C/T的基因型分布( χ2= 0.446, P>0.05)及等位基因频率( χ2= 0.489, P>0.05)差异无统计学意义。

结论

CTLA-4基因第一外显子的(49)A/G位点的多态性与宁夏地区GD的发生可能相关。

关键词: CTLA-4基因; 基因多态性; Graves'病
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)04-0292-04
Research on the correlation of gene polymorphism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 and Graves'disease in Ningxia
KANG Yuzhi1, YANG Baozhen2, WANG Libin2, WU Ruofen2, SHI Zhiyun2
1. Ningxia Medical University, Ningxia Yinchuan 750004, China
2. Laboratory Center, Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Ningxia Yinchuan 750004, China
Abstract
Objective

To investigate the correlation of gene polymorphism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and Graves'disease(GD) in Ningxia.

Methods

The polymorphism at exon 1 position (49) A/G and (318)C/T in the promoter region of the CTLA-4 gene was determined by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method in 61 GD patients and 60 control subjects.

Results

In the exon 1(49)A/G of CTLA-4 gene, the distributions of genotypes( χ2=9.277, P<0.05) and A/G allele( χ2= 10.831, P<0.05) in GD patients differed significantly with control subjects. The distributions of genotypes in CTLA-4(318)C/T ( χ2= 0.446, P>0.05)and C/T allele ( χ2= 0.489, P>0.05)had no significant difference.

Conclusions

The polymorphism of CTLA-4(49)A/G genotypes may be susceptive to GD in Ningxia.

Keyword: Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4; Gene polymorphism; Graves' disease

Graves'病(Graves' disease, GD)是一种多基因引起的以T淋巴细胞功能紊乱为主的自身免疫性甲状腺肿, 属于自身免疫甲状腺病(autoimmune thyroid disease, AITDs)之一, 发病依赖于基因和环境因素的共同作用, 病因未明。研究发现, 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因是活化T细胞表面所表达的一种膜融合蛋白, 对T细胞的活化起关键的负性调节作用, 且CTLA-4基因多态性与GD的发病有很大相关性, 并存在种族差异性。我们就宁夏地区CTLA-4基因的多态性与GD病的相关性进行了探讨。

材料和方法
一、主要试剂和仪器

BbvⅠ 限制性内切酶及MseⅠ 限制性内切酶由纽英伦生物技术(北京)有限公司提供; 血液DNA提取试剂盒、Taq HS DNA聚合酶和dNTP由宝生物(大连KaTaRa)生物技术公司提供; 引物由上海生工生物工程公司合成; MasterCycler聚合酶链反应(PCR)扩增仪(德国Eppendorf公司); Gel Doc 2000凝胶图像分析系统(美国BIO-RAD公司)。

二、研究对象

GD患者组共61例, 其中男20例、女41例, 平均年龄(43.7± 11.5)岁, 均为宁夏医科大学附属医院内分泌科2007年1月至2009年5月的住院患者。其中突眼症20例, 有家族史20例。GD的诊断依据《内科学》(第6版):患者有甲状腺功能亢进的临床症状、体征, 血清甲状腺相关激素同位素检测异常, 促甲状腺激素受体抗体(TRAb)阳性, B超检查证实有弥漫性甲状腺肿。60名正常对照组来自宁夏医科大学附属医院体检者, 男23名, 女37名, 平均年龄(38.86± 11.75)岁, 身体健康, 排除有甲状腺功能亢进、1型糖尿病、类风湿等其他自身免疫性疾病, 与患者无血缘关系。

三、方法

1. DNA的提取 采集外周静脉血5 mL, 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝, 按KaTaRa全血DNA提取试剂盒说明步骤完成外周血基因组DNA提取, TE缓冲液溶解后于-20 ℃保存。

2. 引物合成 CTLA-4基因SNP(49)A/G多态性和SNP(318)C/T多态性的引物合成:将文献报道的引物序列, 经Generunner 10软件检测分析后确定。

3. PCR扩增 PCR扩增CTLA-4(49)A/G位点, 引物上游:5'-GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3', 下游:5'-AGTCTCACTCACCTTTGCAG-3', 扩增片段长度为162 bp。PCR扩增CTLA-4基因启动子C318T位点, 引物上游: 5'-AAATGAATTGGA CTGGATGGT-3'; 下游: 5'-TTACGAGAAAGGAAG CCGTG-3', 扩增片段长度为247 bp。

4. PCR反应体系 在50 μ L扩增体系中, 基因组DNA 200~400 ng, dNTP 0.15 mmol/L, 引物0.15 mmol/L, MgCl2 25 mmol/L, 10× Buffer缓冲液5 μ L, HS Taq DNA聚合酶1 U。

5. 反应条件 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 循环35周后于72 ℃终延伸5 min, 上样于2.0%的琼脂糖凝胶电泳。100 V恒压电泳, 经溴化乙锭染色10 min后, 在紫外凝胶成像分析仪上照像, 观察结果。

6. 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 选取BbvⅠ 限制性内切酶对外显子1扩增产物进行酶切; MseⅠ 限制性内切酶对启动子扩增产物进行酶切。酶切体系为20 μ L, 37 ℃水浴过夜, 分别于6%聚丙烯酰胺凝胶和2.0%琼脂糖凝胶电泳, 扫描成像同时进行基因型鉴定。

四、统计学方法

经Hardy-Weinberg平衡法检验各组基因频率、等位基因的分布; 计量资料以 ± s表示; 组间基因型、等位基因频率的比较用χ 2检验, 统计学处理采用SPSS11.5 for Windows软件分析。

结果
一、酶切结果

根据电泳结果, CTLA-4(49)A/G有AA、AG和GG 3种基因型。基因型为GG时, 162 bp的PCR产物被消化为88 bp和74 bp 2个片段; 基因型为AA时则不能被酶切, 电泳后只有1条162 bp片段; 基因型为AG型时, 则有3条片段, 分别是74、88和162 bp。见图1。CTLA-4(318)C/T有CC、CT和TT 3种基因型。基因型CC产生226和21 bp 2种片段; 基因型CT产生226、130、96和21 bp 4种片段; 基因型TT产生130、96和21 bp 3种片段, 其中21 bp片段小, 难以分辨。见图2。

图1 SNP49(A/G)基因PCR扩增片段经BbvⅠ 酶切的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图2 CTLA-4 基因SNP-318位点的PCR产物经MseⅠ 酶切的电泳图谱

二、CTLA-4外显子1(49)A/G和启动子(318)C/T基因型和等位基因频率比较

对61例GD患者组和60名对照组外显子1 SNP(49)A/G基因进行遗传平衡的χ 2检验, 3种基因型频率分布均具有群体代表性。基因型分布及等位基因频率比较, 差异均有统计学意义(χ 2=9.277, P< 0.05; χ 2= 10.831, P< 0.05); 启动子SNP(318)C/T基因进行遗传平衡的χ 2检验, 3种基因型频率分布具有群体代表性, 基因型分布及等位基因频率比较, 差异均无统计学意义(χ 2= 0.446, P> 0.05; χ 2= 0.489, P> 0.05), 见表1。

表1 GD患者组和对照组CTLA-4 SNP A49G位点和SNP C318T位点基因型及等位基因频率的比较
三、CTLA-4外显子1(49)A/G和启动子(318)C/T在有家族史和散发患者中的多态性比较

按照患者是否具有GD家族史将其分类, 2组间在2个位点的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(P> 0.05), 见表2。

表2 GD患者按家族史分组后SNP A49G位点和SNP C318T位点基因型及等位基因频率比较
讨论

CTLA-4基因位于人类染色体2q33, 参与T细胞的调节, 且只在激活的T细胞表面表达, 传递阻止信号, 终止T细胞活化, T细胞应答在GD发病过程中起重要作用。研究表明, GD是在遗传基础上由感染等应激因素引发的, 属于抑制性T淋巴细胞功能缺陷所致的一种自身免疫性疾病。CTLA-4基因突变可能影响CTLA-4在细胞表面的表达及与B7分子的亲和力, 减弱其对T细胞的抑制作用, 使抑制T细胞增殖、浸润的能力减弱, 导致T细胞增殖和自身耐受的破坏, 产生抗甲状腺自身抗体, 影响GD的发生和复发。CTLA-4是一种具有高度多态性的基因, 与GD相关的CTLA-4基因多态性主要有3个, 分别是位于第一外显子区(49)A/G、位于启动子区(318)C/T和位于在3'-UTR(AT)n多态性位点。其中第一外显子49位为前导序列, A/G基因多态性可以产生翻译产物, 目前对其研究较多, A→ G的改变造成苏氨酸突变为丙氨酸, 可能改变其前导肽链的功能, 引起CTLA-4在胞内池和细胞表面错误的移位, 使携带丙氨酸的CTLA-4分子从胞内向细胞表面的迁移能力减弱[1]。

国内外虽然有CTLA-4基因多态性与多种自身免疫性疾病之间相关关系的报道, 但所显示的结果并不完全一致。Yanagawa等[2]报告美国白种GD患者与CTLA-4多态性有较少的相关性, 在德国、加拿大及韩国人群中启动子多态性与GD显著相关[3, 4], 而英国、突尼斯、日本的研究未发现此种相关性[5, 6]。Antonio等[7]对150例意大利GD患者和301名对照者进行研究, 发现CTLA-4(49)A/G的G等位基因是与GD相关的独立易感因子。Maurer等[8]发现携带GG基因型者其细胞表面CTLA-4分子的表达减少, 是GD的易感因子。国内吕玲等[9]研究发现GD发病与CTLA-4第3外显子的3'非翻译区二核苷酸(AT)重复序列106 bp和CTLA-4外显子1(49)A/G等位基因多态性相关, 但与CTLA-4(318)C/T多态性有较少的相关性。周文旭等[10]提出CTLA-4基因的外显子1(49)A/G和启动子(318)C/T的多态性均与GD的遗传易感性相关, 但启动子C等位基因与GD的相关性是因为其与外显子1G等位基因连锁不平衡所致。其他有关CTLA-4基因外显子1(49)A/G等位基因多态性与GD相关性的文献中, 也均支持G等位基因与GD的发病有很大相关性[11, 12]。

本研究采用PCR-RFLP技术, 对CTLA-4基因第1外显子49位点及启动子318位点的基因多态性与GD的相关性进行综合分析, 支持外显子49位点的G等位基因可能是GD的危险因素之一, GD患者组CTLA-4基因外显子1(49)A/G与对照组差异有统计学意义, 在宁夏人群患GD的发生发展中可能发挥作用, 这与国内部分研究结果一致。但GD患者组与对照组的CTLA-4基因启动子(318)C/T位点基因型及等位基因频率相比较差异均无统计学意义。分析有家族史和散发患者中的CTLA-4外显子(49)A/G和启动子(318)C/T多态性, 发现2组间在2个位点的基因型和等位基因频率差异并不明显。由于不是大样本, 本研究中没有分析宁夏回、汉族人群之间GD患病与CTLA-4基因的相关性。

值得注意的是, 并不是所有研究都表明单个CTLA-4基因多态与GD易感性关联相同, 原因可能是多方面的, 如CTLA-4基因多态与种族、地区差异; 抽样本身存在的偏差和样本量的大小; DNA修复损伤能力等诸多因素。总之, 基因、环境交互作用与GD易感性的关联还值得进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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