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叶惠芬, 陈惠玲, 刘平, 赵子文, 蔡昭炜. 广州地区多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究. 25(4): 288-291
YE Huifen, CHEN Huiling, LIU Ping, ZHAO Ziwen, CAI Zhaowei. Research on the resistant genes of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa from Guangzhou . Labratory Medicine, 25(4): 288-291  
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广州地区多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究
叶惠芬, 陈惠玲, 刘平, 赵子文, 蔡昭炜
广州市第一人民医院,广东 广州 510180

作者简介：叶惠芬,女,1960年生,学士,主任医师,主要从事细菌耐药机制研究。

基金:广州市科技攻关项目(2006ZI-E0141)
摘要
目的

探讨广州地区临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因。

方法

采用纸片扩散法进行药敏试验,聚合酶链反应(PCR)对多重耐药铜绿假单胞菌进行β-内酰胺酶相关基因和氨基糖苷类修饰酶基因检测,并对耐药基因进行测序。

结果

38株铜绿假单胞菌对多黏菌素B耐药率是0%,对其余抗菌药物耐药率均>50%,氨基糖苷类修饰酶基因ant(2″)-Ⅰ、ant(3″)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ和aac(3)-Ⅱ基因阳性率分别为21.1%、39.5%、28.9%、31.6%和21.1%,未检出aac(3)-Ⅰ基因;β-内酰胺酶基因OXA-10、TEM-1、DHA-1、PER-1和IMP-1基因阳性率分别为42.1%、18.4%、10.5%、7.9%和31.6%,未检出CTX-M-9基因和VIM基因;另外OprD2基因缺失率达60.5%。

结论

广州地区多重耐药的铜绿假单胞菌携带多种β-内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶基因,应引起高度重视。

关键词: 铜绿假单胞菌; 多重耐药; 耐药基因
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)04-0288-04
Research on the resistant genes of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa from Guangzhou
YE Huifen, CHEN Huiling, LIU Ping, ZHAO Ziwen, CAI Zhaowei
The First Municipal People's Hospital of Guangzhou, Guangdong Guangzhou 510180, China
Abstract
Objective

To investigate the resistant genes of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolated from Guangzhou area.

Methods

The antimicrobial susceptibility was evaluated by disk diffusion test. The β-lactamase gene and aminoglycoside-modifying enzyme gene carried on multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa were detected by polymerase chain reaction (PCR), and the resistant gene sequences were identified.

Results

The resistance rate of 38 Pseudomonas aeruginosa isolates to polymyxin B was 0%, and the resistance rates of other antibiotics were more than 50%. The positive rates of ant(2″)-Ⅰ, ant(3″)-Ⅰ, aac(6')-Ⅰ,aac(6')-Ⅱand aac(3)-Ⅱamong aminoglycoside-modifying enzyme genes in 38 multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa were 21.1%,39.5%, 28.9%,31.6% and 21.1% respectively. Aac(3)-Ⅰ gene was not found. The positive rates of OXA-10,TEM-1,DHA-1,PER-1 and IMP-1 among β-lactamase genes were 42.1%,18.4%,10.5%,7.9% and 31.6% respectively. CTX-M-9 and VIM genes were not found. The loss rate of OprD2 gene was 60.5%.

Conclusions

The multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa carrying a variety of β-lactamase and aminoglycoside-modifying enzyme genes in Guangzhou area should be paid much attention.

Keyword: Pseudomonas aeruginosa; Multidrug-resistance; Resistant gene

铜绿假单胞菌是医院感染常见致病菌[1]。近年来, 由于抗菌药物广泛应用, 该菌多重耐药率呈明显上升趋势, 研究发现铜绿假单胞菌可通过获得多种β -内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶而导致耐药[2, 3]。为了解本地区临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药机制, 指导临床合理用药, 本研究采用聚合酶链反应(PCR)对临床分离的38株多重耐药铜绿假单胞菌分别检测相关β -内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶基因。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 从广州市6家医院(广州市第一人民医院、中山大学第二附属医院、广州军区广州总医院、南方医科大学珠江医院, 广州红十字会医院和广州医学院第三附属医院)2005年3月至2008年6月住院患者临床标本中收集铜绿假单胞菌1 680株, 利用纸片扩散法筛选出多重耐药的菌株, 对3类或3类以上抗菌药物耐药的菌株判定为多重耐药铜绿假单胞菌, 共38株, 占总菌株的2.26%(38/1 680), 其中从痰液分离菌株30株、中段尿3株、创伤和伤口分泌物5株; 按病区分布, 中心重症监护病房(ICU)11株、呼吸内科8株、综合病区7株、神经内科4株、泌尿外科3株、外科5株。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 35218)和铜绿假单胞菌(ATCC 27853), 由默沙东有限公司赠送。

2.试剂 药敏纸片和水解酪蛋白胨(MH)琼脂均为英国Oxoid公司产品, 包括哌拉西林、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、美罗培南、亚胺培南、哌拉西林-三唑巴坦、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星、环丙沙星、多黏菌素B药敏纸片; PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。Premix Taq DNA聚合酶为大连宝生物有限公司生产。

3.仪器 生物梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定仪, PE9600PCR扩增仪(美国PE公司), 英国UVI凝胶成像仪Gas和电泳仪(BIO-RID公司)。

二、方法

1. 药敏试验 采用纸片扩散法测定。试验操作、质控和药敏结果判断依据为2008年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准。

2. 模板的制备 采用煮沸法。将选取的38株多重耐药铜绿假单胞菌接种在MH琼脂平皿上孵育18~24 h后, 选取数个菌落至离心管, 加入灭菌蒸馏水150 μ L, 煮沸10 min后立即放冰上冷却, 于4 ℃ 12 000 r/min(离心半径为4 cm)离心5 min, 取上清液作为PCR模板立即使用, 或置-20 ℃冰箱备用。

3. 引物设计和PCR反应条件 各种靶基因引物序列参考文献[4, 5], 由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应条件参照文献和软件推荐数值进行。引物序列及预期产物大小见表1。各种靶基因 PCR扩增体系均为:总反应体积20 μ L, 其中P1、P2引物各1 μ L, Premix Taq DNA聚合酶10 μ L, 灭菌蒸馏水7 μ L, 模板液1 μ L。热循环参数根据目的产物大小有所不同, PCR扩增产物> 500 bp的基因热循环参数为:93 ℃预变性3 min, 93 ℃变性60 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s, 35个循环后72 ℃延伸 5 min; PCR扩增产物< 500 bp的基因热循环参数为:93 ℃预变性3 min, 93 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s, 35个循环, 最后72 ℃延伸5 min。用双蒸灭菌水作模板设阴性对照。反应结束后取5 μ L PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 核酸染液染色, 同时加核酸电泳相对分子质量标准鉴定扩增DNA片段的大小。用凝胶成像系统观察结果并照相。每种PCR阳性产物选2株送上海英骏生物技术有限公司进行纯化并测序, 测序结果与GenBank 中Blast进行比对。

表1 PCR扩增相关耐药基因所用引物及产物长度
结果
一、38株铜绿假单胞菌药敏情况

除对多黏菌素B未出现耐药外, 对其余各种抗菌药物耐药率都在50%以上, 结果见表2。

表2 38株铜绿假单胞菌药敏情况(%)
二、基因PCR检测

38株多重耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因以ant(3″)-Ⅰ 基因(39.5%)多见, β -内酰胺酶基因以OXA-10(42.1%)和IMP-1基因(31.6%)多见, OprD2基因缺失率达60.5%。同时携带2种或2种以上耐药基因的占55.3%, 携带2种以上氨基糖苷类修饰酶基因的有42.1%, 携带2种以上β -内酰胺酶基因的有36.8%。基因分型和基因型构成结果见表3和表4。

表3 38株铜绿假单胞菌基因分型
表4 38株铜绿假单胞菌基因型构成
讨论

多重耐药铜绿假单胞菌所致的院内感染正日渐引起关注, 特别是对所有药物(多黏菌素B除外)耐药的泛耐药株的出现, 使临床面临的挑战更加严峻。因此, 调查其耐药情况, 一方面可全面认识其耐药机制, 有助于感染控制, 另一方面铜绿假单胞菌有可能是多种耐药基因的传染源, 这一工作将有助于了解和控制医院内耐药基因的播散和流行。本地区38株多重耐药铜绿假单胞菌除对多黏菌素B耐药率为0%外, 对其余的各种抗菌药物耐药率都较高, 耐药率均> 50%。因此应重视和加强细菌耐药监测, 根据药敏结果合理选用耐药率低的抗菌药物, 可避免多重耐药菌株引起的医院感染发生。另外, 本次调查中未发现多黏菌素B耐药菌株, 因此临床医生对这类菌株引起的感染可根据患者具体情况考虑选用多黏菌素B。

铜绿假单胞菌携带多种β -内酰胺酶编码基因(广谱酶或超广谱β -内酰胺酶如TEM、SHV、OXA型、AmpC金属β -内酰胺酶等)和OprD2基因缺失是导致铜绿假单胞菌对β -内酰胺酶类抗菌药物耐药的主要原因。β -内酰胺酶类抗菌药物作用靶位是细菌内膜上的青霉素结合蛋白(PBPs)。该类药物要达到其作用靶位必须先经过外膜通道进入周浆间隙。如果细菌外膜通道蛋白缺失, 药物难以到达其作用靶位, 细菌将产生耐药, 铜绿假单胞菌外膜蛋白中OprD2是亚胺培南进入菌体的特异性通道。本研究中OXA、TEM、DHA、PER、IMP的阳性率分别是42.1%、18.4%、10.5%、7.9%和31.6%, 60.5%菌株存在OprD2基因缺失, 同时携带多种耐药基因的比率较高, 与文献[4~6]报道有所差异, 这可能与不同地区、不同时期细菌耐药基因携带状况不同有关; 同时也提示携带多种β -内酰胺酶基因合并外膜通道蛋白OprD2基因缺失是本地区铜绿假单胞菌对β -内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。

氨基糖苷类与β -内酰胺类抗菌药物合用曾是治疗铜绿假单胞菌感染的一线药物, 但由于泛用和过度使用氨基糖苷类药物, 耐药问题随之突现, 细菌对该类药物耐药是因为产氨基糖苷类修饰酶和该类药物作用靶位16SrRNA基因突变而致。本研究ant(3″)-Ⅰ 基因的阳性率为39.5%, 其他氨基糖苷类修饰酶基因ant(2″)-Ⅰ 、aac(6')-Ⅰ 、aac(6')-Ⅱ 和aac(3)-Ⅱ 基因阳性率分别为21.1%、28.9%、31.6%和21.1%, 未检出aac(3)-Ⅰ 基因, 同一菌株同时携带2种以上氨基糖苷类修饰酶基因的有42.1%, 可以看出本地区氨基糖苷类修饰酶基因对铜绿假单胞菌的耐药性起到重要作用。研究发现有些菌所检测基因全部阴性, 但也表现出高度的耐药性, 提示可能存在其他耐药机制, 有待进一步研究。

耐药细菌在全世界范围内的传播将会成为全人类重大的健康安全隐患, 应引起临床关注, 合理使用抗菌药物, 同时加强感染控制措施, 及时切断多重耐药株的克隆和水平传播, 密切监测耐药株的变迁及发展。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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