引用本文
姜伟, 杨永长, 肖代雯, 张琳琳, 韵雪雪, 刘华, 黄文芳. 应用金芯片技术预测肾功能损害的临床应用研究. 25(4): 278-282
JIANG Wei, YANG Yongchang, XIAO Daiwen, ZHANG Linlin, YUN Xuexue, LIU Hua, HUANG Wenfang. Research on the clinical application of the prediction of early kidney injury by Au protein chip technology. Labratory Medicine, 25(4): 278-282  
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《检验医学》编辑部
应用金芯片技术预测肾功能损害的临床应用研究
姜伟1, 杨永长1, 肖代雯1, 张琳琳1, 韵雪雪2, 刘华1, 黄文芳1
1. 四川省医学科学院 四川省人民医院检验科,四川 成都 610072
2. 重庆医科大学检验系,重庆 400016

通讯作者：黄文芳,联系电话：028-87394056。

作者简介：姜伟,男,1981年生,硕士,技师,主要从事检验医学信息学研究。

基金:四川省卫生厅资助项目(080331)
摘要
目的

探讨利用金(Au)芯片检测尿蛋白质指纹图谱在预测肾功能损害中的应用价值。

方法

利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术及Au芯片检测186例肾病患者和188例对照者尿蛋白质指纹图,分析肾病患者与对照组尿蛋白质表达差异并筛选标志蛋白质,结合人工神经网络(ANN)技术建立智能预测模型,评价其诊断肾病的应用价值。对部分差异蛋白质通过电喷雾四级杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)进行鉴定。用免疫散射比浊法检测尿微球蛋白并与蛋白质指纹图谱结果比较,评价SELDI-TOF-MS检测性能。

结果

肾病患者与对照者尿中共检测到214个蛋白质峰,有69个蛋白质峰差异有统计学意义( P<0.05),筛选其中质荷比(m/z)11 735、23 770、51 720、58 720、67 650、80 045、91 240蛋白质建立的ANN模型预测肾功能损害的灵敏度为98.8%(85/86),特异度为96.6%(85/88)。蛋白鉴定结果表明m/z 11 735、23 770、67 650、80 045蛋白质分别为β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、白蛋白、转铁蛋白。SELDI-TOF-MS检测微球蛋白较免疫散射比浊法更灵敏。

结论

基于Au蛋白芯片技术的尿蛋白质指纹图谱检测,可快速、灵敏、高通量的显示尿蛋白质表达情况,对诊断肾损伤、判断蛋白尿类型及治疗评价具有重要的应用价值。

关键词: 蛋白芯片; 肾病; 蛋白质标志物; 人工神经网络
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)04-0278-05
Research on the clinical application of the prediction of early kidney injury by Au protein chip technology
JIANG Wei1, YANG Yongchang1, XIAO Daiwen1, ZHANG Linlin1, YUN Xuexue2, LIU Hua1, HUANG Wenfang1
1. Department of Clinical Laboratory,Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital,Sichuan Chengdu 610072,China
2. Faculty of Laboratory, Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China
Abstract
Objective

To determine urine protein profilings by Au chip and discuss the clinical significance in sensitivity and the rapid prediction of renal function.

Methods

The study collected 186 patients with nephropathy and 188 controls. The urine protein profilings were determined by surface-enhanced laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) and Au chip. The expression differences of urine protein and protein markers were analyzed and screened between the patients and controls. An artificial neural network (ANN) pattern was developed to evaluate the application significance. The differential protein markers were primarily identified by electrospectrometry ionization quadrupole time of flight mass spectrometry (ESI-Q-TOF-MS). The results of urine microglobulin detected by immune scatter turbidimetry and protein profilings detected by SELDI-TOF-MS were comparatively analyzed.

Results

Total of 214 protein peaks and 69 distinguished peaks ( P<0.05) were obtained from the urine samples of patients with nephropathy and the controls. The peaks with mass-to-charge ratio (m/z) 11 735,23 770,51 720,58 720,67 650, 80 045 and 91 240 were screened by ANN. The sensitivity was 98.8%(85/86) and the specificity was 96.6% (85/88). 4 specific protein peaks (m/z at 11 735,23 770,67 650 and 80 045)were identified and considered as β2-microglobulin,α1-microglobulin,albumin and transferrin,respectively. The SELDI-TOF-MS was more sensitive than immune scatter turbidimetry.

Conclusions

Au chip is a fast, sensitive and high-through method to detect urine protein profilings from patients with nephropathy. It has the application significance in the diagnosis of nephropathy,the identification of albuminuria and the evaluation of renal injury.

Keyword: Protein chip; Nephropathy; Protein marker; Artificial neural network

蛋白尿是确定肾脏功能损害的重要标志, 也是导致多种临床表现的病理生理基础, 尤其是大量蛋白尿的出现[1]。目前实验室常规方法对于临床期蛋白尿的检测具有重要价值, 此时虽然诊断已经确立, 但治疗效果大多欠满意[2]。探索更早期肾脏损害的特征, 从而早期诊断和干预治疗, 对于肾病的治疗效果和预后意义更大。此外, 区分成分复杂的尿蛋白中某种蛋白质成分在疾病发生发展过程中的动态变化, 对于阐述致病机制具有重要意义。我们利用金(Au)芯片技术检测肾病患者尿蛋白质指纹图谱, 筛选肾病患者尿蛋白质标志, 寻找灵敏、快速预测肾功能损害的新方法。

材料和方法
一、研究对象

1. 肾病组 为2008年3月至2009年2月四川省人民医院内分泌科和草堂病区肾内科的确诊病例, 共186例。包括糖尿病肾病70例、肾病综合征31例、急性肾功能衰竭29例、慢性肾功能衰竭28例、IgA肾病16例、狼疮肾炎6例和药物性肾功能损害6例。其中男96例、女90例, 年龄21~80岁。所有患者无过敏、尿路感染、心力衰竭、肿瘤等所致的肾脏病变。

2. 对照组 包括同期健康体检者80名, 男44名, 女36名, 年龄19~76岁; 膀胱炎和前列腺增生患者各20例, 泌尿道结石病患者68例, 其中男58例、女50例, 年龄21~58岁。利用Excel 2003软件随机抽样, 将肾病和对照样本分为:(1)训练组, 肾病和对照各100例, 筛选尿蛋白标志物并建立人工神经网络(ANN)模型; (2)验证组, 肾病86例和对照88例, 采用盲法验证模型, 评价临床诊断效能。

二、方法

1. 样本 收集受试者清晨中段尿10 mL于4 ℃冰箱中, 30 min内吸取1 mL于离心管中, 4 ℃ 5 000 r/min(离心半径5 cm)离心5 min, 将分离的上清尿样本分装50 μ L/管, 冻存于-80 ℃冰箱中备用。

2. 制备样本混合液 取出冻存的尿样本置于冰上缓慢融解后4 ℃ 11 000 r/min(离心半径5 cm)离心3 min。取出上清尿样本加入96孔扩增板中, 每孔5 μ L, 然后迅速加入半饱和芥子酸(SPA)5 μ L, 振荡混匀, 制成样本混合液。

3. 芯片活化 取出Au芯片(美国Bio-Rad公司)装入生物处理器中, 每孔加丙酮100 μ L, 室温震荡活化5 min, 拍干。再依次加入0.01 mmol/L HCl、0.01 mmol/L HCl-甲醇(1∶ 1)液、甲醇溶液各100 μ L, 每次震荡活化5 min后甩去, 晾干。

4. 上样 活化的芯片表面每孔点加样本混合液2 μ L, 放置15 min后再点加SPA 1 μ L, 晾干后即可上机测量。

5. 质量控制 基于“ 外标法” 进行质量控制[3], 即配制标准蛋白对照溶液(0.01 mg/mL胰岛素, 美国Sigma-Aldrich公司), 质荷比(m/z)5 733.58。每条芯片随机选择一个点点加对照溶液与样本同步检测, 比较获得的标准对照品质谱峰丰度。通过已知的标准对照品峰m/z对其他蛋白质的相对分子质量进行校正。统计不同芯片上的标准对照品质谱峰丰度, 计算变异系数(CV)以评价精密度。

6. 数据采集与分析 利用PBSⅡ /C型蛋白质指纹图谱仪(美国赛弗吉公司)对结合在Au芯片表面的蛋白质进行检测。设定检测范围m/z 0~100 000, 系统优化范围m/z 2 000~20 000, 检测激光强度190, 敏感度8。采用Ciphergen Proteinchip 3.0软件自动采集数据并进行均一化处理及相对分子质量校正。以正态因子衡量图谱间差异的大小, 当结果为0.3~3.0之间, 差异在可接受范围。采用Biomarker Wizard 3.1软件对获得的尿蛋白质谱图进行聚类分析, 设定有意义的蛋白质峰出现频率阈值为10%, 分别设定5、2两次信噪比(S/N)过滤。确定2组间蛋白质峰值比较时, 采用 ± s表示, 对初步筛选的蛋白质峰进行t检验, 以P< 0.05表示差异有统计学意义。

7. 建立预测模型 ANN技术是根据生物神经系统的作用原理发展起来的、由多个人工神经元互联组成的大规模分布式并行信息处理系统[4]。本研究采用基于误差反传原理的多层前馈神经网络, 以筛选的差异蛋白质峰丰度作为输入节点, 设定肾病患者的目标输出值为1, 对照的目标输出值为0, 以0.5为cut-off值。利用训练组样本建立ANN预测模型并进行反复训练, 调整模型检测参数, 以完全区分所有肾病患者和对照者时诊断效能最高, 该状态下的模型参数为最佳检测参数, 建立并储存模型。

8. 盲法模型验证 采用双盲的方法, 将验证组中样本的蛋白标志物数据作为输入节点, 利用储存的模型进行模拟仿真计算。当得到的预测输出值> 0.5时, 归类为肾病; 当预测输出值≤ 0.5时, 归为对照者。利用盲法验证的结果进行诊断效能评价。

9. 标志物初步鉴定 选取质谱图中有大量蛋白质表达的10份肾病患者尿样本, 混合后利用电喷雾四级杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF, 美国Waters公司)对差异蛋白质进行鉴定, 通过MassLynx V4.1软件获取数据并保存为PKL文档[5]。通过MASCOT程序(www.matrixscience.com)对数据进行分析, 设置参数:Database, NCBInr; taxonomy, Homo sapiens(human); enzyme, trypsin, allowing up to one missed cleavage; Fixed modifications, Carbamidomethyl(C); Variable modifications, oxidation; peptide mass tolerance, 1.2 dalton; MS/MS mass tolerance, 0.6 dalton; peptide charge, 2+。2个或多个肽段MOWSE分数均超过阈值(P< 0.05), 表明相互匹配。

10. 与免疫散射比浊法相比较 将SELDI-TOF-MS检测发现微球蛋白表达增高的样本分别稀释10倍、100倍、1 000倍。利用SELDI-TOF-MS和免疫散射比浊法(BNP 特种蛋白仪, 德国 Date Behring 公司)比对检测样本原液及稀释后样本, 以判断SELDI-TOF-MS技术是否具有定量分析优势, 并评价仪器检测灵敏度。

结果
一、标准对照品结果

标准对照品蛋白质峰丰度为70.1± 8.1, CV为11.6%。

二、建立蛋白标志物模型

获得的肾病患者和对照者尿蛋白质指纹图(见图1)进行分析后, 标准系数为2.16, 正态因子为0.3~3.0。聚类分析后共得到214个蛋白质峰。肾病组与对照组相比较, 有69个蛋白质峰差异有统计学意义。统计15个P< 0.001的蛋白质峰, 其中高表达蛋白质峰11个, 主要为大分子蛋白, m/z分布为30 000~100 000, 表达丰度范围为0.5~18.4; 低表达蛋白质峰4个, 主要为小分子蛋白, m/z分布为2 400~25 000, 表达丰度范围为0.1~4.1。将这些差异蛋白作为潜在蛋白标志物分别优化组合, 利用训练组样本进行反复训练, 建立ANN预测模型。结果显示以 m/z 11 735、23 770、51 720、58 720、67 650、80 045、91 240共7个蛋白质数据作为输入节点, 隐含层和输出层节点分别设置为6、1, 训练次数10 000, 学习率0.02时建立的诊断模型仿真计算效能最高, 聚类分析图也表明以上7个标志物表达差异最明显, 见图2。利用此时的数据参数建立并储存模型。

图1 健康体检者、泌尿道结石患者与肾病患者尿蛋白指纹图和凝胶图比较

图2 肾病患者与对照者间筛选的7个尿蛋白标志物聚类分析图

三、盲法模型验证

利用验证集中样本对模型进行盲法验证, 结果显示86例肾病患者有1例判断错误, 而88例对照者有3例错判。该模型预测肾病的灵敏度和特异度分别为98.8%(85/86)、96.6%(85/88)。受试者工作特征(ROC)曲线下面积为0.979, 见图3。

图3 肾病患者尿蛋白标志物预测模型ROC曲线分析

四、差异蛋白质的初步鉴定

结果表明肾病患者尿质谱图中几个差异表达的蛋白质m/z 11 735、23 770、67 650和80 045分别为β 2-微球蛋白(gi|40787843)、α 1-微球蛋白 (gi|28637)、白蛋白(gi|2492797)、转铁蛋白(gi|4557871), 见图4。

图4 肾病患者尿蛋白标志物鉴定结果

五、蛋白尿类型

肾病患者间尿蛋白质指纹图谱比较, 28例仅有微球蛋白表达增高, 无白蛋白等大分子量蛋白质表达, 为肾小管性蛋白尿; 26例出现白蛋白等高分子量蛋白质表达增高, 而未见β 2-微球蛋白表达增高, 为肾小球性蛋白尿。其余患者尿中大、小分子蛋白质均表达增高, 为混合性蛋白尿。见图5。

图5 尿蛋白指纹图用于蛋白尿类型的判断

六、微球蛋白检测结果

将SELDI-TOF-MS检测发现微球蛋白表达增高的样本, 同步利用免疫散射比浊法比对检测微球蛋白。结果见表1。

表1 采用免疫透射比浊法和SELDI-TOF-MS检测尿β 2-微球蛋、α 1-微球蛋白结果比较(± s)
讨论

肾脏疾病患者初期一般无明显的症状和体征, 常规的检查方法难以发现尿蛋白质的阳性结果, 一旦发展到蛋白尿阶段则很有可能继续向临床肾病发展而造成严重后果[4]。探索肾脏损害的早期标志, 对肾病诊断、治疗效果及预后具有重要意义。SELDI-TOF-MS是一项优于蛋白电泳、基质辅助激光解析电离(MALDI)技术的临床蛋白质组学研究技术, 国内外的报道表明该技术在糖尿病肾病方面研究取得了一定成果[6]。Dihazi等[7]利用SELDI-TOF-MS及SAX2芯片分析糖尿病肾病患者尿蛋白质表达情况, 结果预示糖尿病伴微量白蛋白尿患者尿中泛素核蛋白体融合蛋白(UbA52, m/z 14 766)增高可能为糖尿病肾病的诊断标志。Zhang等[8]利用SELDI-TOF-MS及CM10芯片结合串联质谱发现狼疮肾病患者尿中差异表达的27个蛋白质峰, 其中包括Hepcidin亚型和抗胰蛋白酶及白蛋白片段。Nguyen等[9]应用SELDI-TOF-MS及NP20芯片分析心肺分流术患者术后2~6 h与2~3 d发生急性肾功能衰竭患者尿蛋白质谱差异性, 认为相对分子质量为6 400、28 500、43 000、66 000的蛋白质是预测急性肾衰的重要生物标志。这些研究均是基于化学或生物表面芯片, 这一类芯片由疏水、阴、阳离子基团或生物探针结合在芯片载体表面而形成。芯片表面探针结合情况、芯片在空气中的暴露时间等均影响与蛋白质的结合, 另外缺乏对芯片质量有效的控制手段, 同时操作复杂、影响因素众多, 造成检测数据重复性差, 批间精密度不高而难以直接应用和推广。

Au芯片是SELDI-TOF-MS技术近来采用的一种未经任何化学或生物基团修饰的金属表面芯片, 芯片本身质控简单, 可非选择性结合蛋白, 方法快速简便, 干扰因素少[6]。本研究应用SELDI-TOF-MS技术及Au芯片对肾病患者和对照者尿蛋白质谱进行分析, 显示2组间蛋白质表达具有明显差异。利用ANN筛选的7个蛋白质峰作为标志物建立预测模型盲法区分肾病与对照样本的灵敏度和特异性分别为98.8%、96.6%。对其中m/z 11 735、23 770、67 650和80 045的蛋白质鉴定后表明为β 2-微球蛋白、α 1-微球蛋白、白蛋白和转铁蛋白。为了保证实验数据的精密度, 本研究设定正态因子为0.3~3.0之间的图谱进行比对分析, 同时引入m/z 5 733.58的胰岛素作为标准对照品用于质量控制。结果表明Au芯片实验批间重复性较高, 其差异在可接受范围内。另外, 以微球蛋白为观察指标, 我们通过与免疫散射比浊法对不同稀释度的同一样本进行同步检测, 结果证明SELDI-TOF-MS检测尿微球蛋白较免疫散射比浊法更灵敏。

研究结果表明SELDI-TOF-MS技术及Au芯片能有效检测肾病患者尿液蛋白质表达情况, 获得的质谱图包括了蛋白质的数目、大小、种类、含量等全面信息, 对于肾病的诊断、病因探求、判断蛋白尿来源和肾损害类型及程度具有重要意义。但本研究尚存在以下不足:样本量偏小, 患者病程、病种、疾病严重程度等对蛋白质标志物的影响不明; 在筛选出的差异蛋白质中, 有些可能是目前已经明确或正在研究的某些因子, 由于实验技术和经费的原因, 尚未完成对其他未知标志蛋白的分离、提取和鉴定。进一步的研究宜增加样本量, 并对存在的未知蛋白质, 结合肽质量指纹图谱和氨基酸序列分析进行鉴定。总之, 我们采用SELDI-TOF-MS技术及Au芯片直接检测尿蛋白质质谱, 可满足临床肾病的早期检测、肾脏疾病普查及大样本疾病筛查的需要, 在临床上具有重要的应用和推广价值。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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