引用本文
李俐, 蒋燕群. 膜孔蛋白在产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的作用[J].检验医学, 2015,25(11): 864-868
LI Li, JIANG Yanqun. The significance of porin in the AmpC beta-lactamase isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia [J]. Labratory Medicine, 2015,25(11): 864-868  
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膜孔蛋白在产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的作用
李俐, 蒋燕群
上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海 200233

作者简介:李 俐,女,1983年生,学士,主要从事细菌耐药性研究。

通讯作者:蒋燕群,联系电话:021-64369181-58848。

摘要
目的 调查产头孢菌素β-内酰胺酶(AmpC酶)的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌膜孔蛋白的表达情况,分析其耐药机制。方法 收集2003至2009年间产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌65株,三维试验确定细菌AmpC酶的产生情况,多重聚合酶链反应(PCR)扩增ampC基因和膜孔蛋白ompF、ompK35、ompK36基因,实时定量逆转录RT-PCR检测膜孔蛋白的相对表达量,纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性。结果 32株大肠埃希菌中,14株(43.75%)膜孔蛋白ompF转录水平下调;33株肺炎克雷伯菌中,17株(51.52%)膜孔蛋白ompK35、ompK36转录水平下调。结论 在产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中膜孔蛋白的低表达是造成耐药不可忽视的因素之一。
关键词: 膜孔蛋白; 头孢菌素 β-内酰胺酶; ompF; ompK35; ompK36
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)11-0864-05
The significance of porin in the AmpC beta-lactamase isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia
LI Li, JIANG Yanqun
Department of Clinical Laboratory,the Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China)
Abstract
Objective To investigate the expression of the porin in AmpC beta-lactamase isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia and analyze the resistant mechanism.Methods 65 strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia collected from 2003 to 2009 were determined. Three-dimension test was used for the detection of AmpC beta-lactamase, and multiplex polymerase chain reaction(PCR) was used for the amplification of ampC genotype and porin ompF, ompK35 and ompK36 genes. The real-time quantitive reverse transcription (RT)-PCR was used for the detection of the expression level of porin, and the standard disc diffusion method was used for the detection of the antibiotic agent sensitivity.Results Among the 32 strains of Escherichia coli,14 isolates (43.75%) had low ompF transcription level, and 17 (51.52%) of 33 Klebsiella pneumonia had low ompK35 and ompK36 transcription level.Conclusions The low expression of porin is an important mechanism of antibiotics resistance among Escherichia coli and Klebsiella pneumonia.
Keyword: Porin; AmpC beta-lactamase; ompF; ompK35; ompK36

大肠埃希菌一直以来都是公认的感染率最高的细菌, 从上海市第六人民医院6年来的耐药监测分析来看, 大肠埃希菌的分离率始终最高, 肺炎克雷伯菌也在前5名占有一席之地, 不仅如此, 其耐药性也逐年增加。上海市第六人民医院统计数据也显示, 超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)阳性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对3代、4代头孢菌素的耐药率比ESBLs阴性者平均高出30%。在对细菌耐药机制的研究中, β -内酰胺酶一直是关注的焦点, ESBLs、头孢菌素β -内酰胺酶(AmpC酶)相继出现。随着细菌耐药机制的深入研究, 越来越多的人认为酶的水解作用仅是细菌耐药机制的其中一个原因。膜孔蛋白的作用也不可忽视, 但大多将膜孔蛋白与碳青霉烯类抗菌药物耐药相联系, 本研究以产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为研究目标, 分析这些细菌中膜孔蛋白表达情况及其在耐药中的作用。

材料和方法
一、 材料

1. 菌株 筛选出上海市第六人民医院2003年1月至2009年6月对头孢西丁耐药的菌株3 095株, 其中大肠埃希菌1 702株, 肺炎克雷伯菌1 093株。其中产AmpC酶菌株65株, 大肠埃希菌32株, 肺炎克雷伯菌33株。

2. 试剂 药敏纸片均购自Oxoid公司; 聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒、逆转录RT-PCR反应试剂盒、实时定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司; 细菌总RNA提取试剂盒购自天根生物有限公司; 引物由上海生工公司和上海英骏公司合成。

3. 仪器 基因扩增仪(Eppendorf), WALKAWAY-40微生物鉴定药敏系统(Dada-Bering, Sacramento), 实时荧光定量PCR仪(LightCycler Real Time PCR扩增仪, 罗氏)。

二、 方法

1. 三维试验 参照Coudron等 [1]报道对产AmpC酶进行确证, 主要步骤包括:(1)冻融法提取酶粗提物; (2)头孢西丁纸片贴于预接种有大肠埃希菌(ATCC 25922)的水解酪蛋白胨(MH)琼脂平板中央, 酶粗提物加入纸片边缘5 mm处的放射状切裂缝内。

2. 多重PCR试验 筛选产AmpC酶的菌株, PCR反应程序:94 ℃ 3 min, 94 ℃ 30 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 30个循环, 72 ℃ 7 min[2]。

3. PCR检测ompF、ompK35、ompK36基因 热裂解法提取细菌DNA模板, 配置50 μ L体系的反应溶液, 引物见表1。0mpF PCR反应条件为:94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s, 30个循环, 最后延伸72 ℃ 10 min。ompK35、ompK36 PCR反应条件为:94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min, 30个循环, 最后延伸72 ℃ 10 min。

表1 膜孔蛋白PCR和RT-PCR引物

4. 实时定量RT-PCR试验 用实时定量 RT-PCR 分别检测大肠埃希菌ompF和肺炎克雷伯菌ompK35、ompK36的转录水平。引物见表1。(1)提取细菌总RNA 完全按照天根生物有限公司细菌总RNA提取试剂盒的说明书进行操作, 主要步骤包括收集菌体, 裂解细菌, 去除蛋白质和DNA, 溶解并收集总RNA, 测RNA浓度; (2) 将RNA逆转录成cDNA, 按照试剂盒说明书配置10 μ L反应体系, 在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s 的条件下进行反应, 反应产物做为模板进行下一步实时定量PCR; (3) 实时定量PCR 参照说明书配置20 μ L反应溶液, 用说明书推荐的两步法反应程序, 步骤1:95 ℃ 30 s, 20 ℃/s, 1个循环; 步骤2:95 ℃ 5 s, 20 ℃/s、60 ℃ 20 s, 20 ℃/s, 40个循环。 以16s rRNA为内参, 每个样本重复2次取均值, 并设空白对照, 见图1; (4) 分别以大肠埃希菌(ATCC 25922)和肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)为标准对照, 参照Livak等[3]推荐的方法进行分析。以标准菌株的膜孔蛋白转录水平为基准, 临床菌株与其比对。其中域值循环差(Δ CT)=目的基因CT值-内参CT值, 样本域值循环差(Δ Δ CT)=临床菌株目的基因CT值-标准菌株目的基因CT值; 2-Δ Δ CT即为与标准菌株相比cDNA的含量。

图1 实时定量PCR 曲线图

5. 药敏试验 采用纸片扩散法, 结果判定严格按照临床实验室标准化研究所(CLSI)2009年制定的规则及标准判定。药敏纸片包括头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)。

结 果

一、三维试验阳性共105株, 阳性率为3.39%。

二、对三维试验阳性的105株进行多重PCR, 扩增出条带的共65株, 其中DHA群61株, CIT群2株, MOX群2株。大肠埃希菌32株, 肺炎克雷伯菌33株。

三、对多重PCR阳性菌株进行膜孔蛋白PCR基因检测并测序, 大肠埃希菌ompF基因2株缺失, 6株突变(E2、E3、E6、E9、E10、E13); 肺炎克雷伯菌ompK35、ompK36基因则未见异常。从测序结果来看, 有2个突变多发区, 见图2, 导致E2氨基酸从49位到103位发生改变, 且56位到63位连续出现终止密码子, 使氨基酸出现空缺; E3、E6、E9、E10、E13也均在97、98、99位氨基酸位置出现终止密码子而使氨基酸出现空缺。氨基酸的改变导致E2中66位至71位和85位至90位出现异常螺旋; E3 、E6、E9、E13均在野生株膜孔蛋白87位至103位卷曲处形成异常螺旋, 而E10则在二级结构上与野生株无差别。

图2 ompF 基因测序结果比对图

四、实时定量RT-PCR分别检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌膜孔蛋白转录水平后, 大肠埃希菌14株膜孔蛋白ompF表达水平下调, 占43.75%; 肺炎克雷伯菌共有17株膜孔蛋白ompK35、ompK36表达水平下调, 占51.52%。结果见表2。

表2 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌膜孔蛋白下调结果

五、试验菌株药敏试验结果显示, 膜孔蛋白下调组耐药性均高于非下调组, 其中肺炎克雷伯菌更为显著, 见表3、4 。

表3 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌药敏结果
表4 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌抑菌圈结果
讨 论

大肠埃希菌的膜孔蛋白主要分5种:OmpF、OmpC、PhoE、LamB和蛋白K。大多数β -内酰胺类抗菌药物可通过的膜孔蛋白主要为OmpF、OmpC, 其特点为对带有负电荷的物质通透性明显降低, 而正电荷则可促进溶质通过, 因而膜孔蛋白的变异可引起细菌对抗菌药物敏感性下降。膜孔蛋白穿透在外膜的内外两侧, 以三聚体的形式镶嵌在细胞外膜的脂质层中并和胞外相通, 形成胞内胞外物质交换的通道。通过膜孔蛋白扩散的药物主要有β -内酰胺类、喹诺酮类、四环素、氯霉素、氨基糖苷类等。Doumith等[4]分析膜孔蛋白的缺失原因有:(1)突变或多位点插入干扰了编码序列, 导致转录提前终止; (2)起动子区域的点突变影响了转录; (3)未知的作用于转录水平的机制或阻止膜蛋白插入外膜导致了膜孔蛋白的缺失。肺炎克雷伯菌的膜孔蛋白包括OmpK35、OmpK36和OmpK37, OmpK35和OmpK36相当于大肠埃希菌中的OmpF和OmpC, OmpK37一般情况下不表达或表达量极少[5]。目前对于膜孔蛋白的研究大多集中在缺失与β -内酰胺酶联合引起碳青霉烯类耐药。

对于膜孔蛋白的调控, 在大肠埃希菌中研究得较为透彻, 主要包括:(1)EnvZ/OmpR系统, 同时介导着OmpF和OmpC的调控, EnvZ是细胞膜感受器激酶, 当EnvZ缺失时, OmpC不表达而OmpF表达下降, OmpR是细胞质的反应调节器, 其附着在膜孔蛋白基因的起动子区域, 控制着不同种基因的转录; (2)Cpx系统, Cpx应激系统是一个双组分信号传导系统, 包括一个感受器激酶CpxA和一个反应调节器CpxR[6]; (3)micF, micF基因位于染色体-48区, 转录产物micF mRNA为93个核苷酸的反义RNA, 其5'末端可与micF mRNA 5'末端部分互补形成ompF-mRNA-micF RNA双聚体, 干扰ompF基因的转录, 降低ompF mRNA量从而导致OmpF蛋白减少[7]。肺炎克雷伯菌的外膜孔蛋白调控表达目前研究较少。

酶的水解作用一直被认为是细菌耐药的最主要原因, 但近年来越来越多的研究证明耐药的出现并非某一单一因素作用, 而是多因素造成的综合效应, 因此本研究对产AmpC酶的细菌检测其膜孔蛋白在耐药中所起的作用。其中三维试验阳性菌株为105株, 多重PCR阳性65株, 由于对头孢西丁的耐药机制有多种, 如KPC等[8], 同时大肠埃希菌能通过启动子和衰减子的突变, 产生持续高产染色体AmpC酶, 也可致多重PCR不能检测到。通过检测产AmpC酶细菌中膜孔蛋白的转录水平情况发现:(1)在产AmpC酶的大肠埃希菌中膜孔蛋白下调比例为43.75%, 肺炎克雷伯菌中为51.52%, 表明膜孔蛋白的转录水平下调并非是偶然事件; (2)从药敏结果来看, 膜孔蛋白下调组对3代、4代头孢菌素的耐药率均高于非下调组, 特别是肺炎克雷伯菌, 耐药率增高20%左右。同时就抑菌圈统计结果来看, 膜孔蛋白下调组耐药性均高于非下调组, 这也进一步说明, 细菌对头孢菌素类抗菌药物耐药的各种原因中, 膜孔蛋白是其中重要原因之一, 产酶合并膜孔蛋白下调使细菌对头孢菌素类抗菌药物耐药性增加。提示我们对耐β -内酰胺类抗菌药物的细菌, 除了检测细菌AmpC酶的同时不能忽视膜孔蛋白的作用; (3)对突变株进行测序并比对发现, 基因突变后使得氨基酸发生改变, 导致膜孔蛋白的二级结构发生改变, 使膜孔蛋白的功能降低从而造成耐药。综上所述, 对3代、4代头孢菌素的耐药除了酶的作用外, 膜孔蛋白也发挥了不小的作用, 这对于临床用药以及临床微生物工作者都有一定的警示作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(5): 1791-1796. [本文引用:1]
[2] Pérez-Pérez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(6): 2153-2162. [本文引用:1]
[3] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. [本文引用:1]
[4] Doumith M, Ellington MJ, Livermore DM, et al. Molecular mechanisms disrupting porin expression in ertapenem-resistant Klebsiella and Enterobacter spp. clinical isolates from the UK[J]. J Antimicrob Chemother, 2009, 63(4): 659-667. [本文引用:1]
[5] Doménech-Sánchez A, Hernández-Allés S, Martínez-Martínez L, et al. Identification and characterization of a new porin gene of Klebsiella pneumoniae: its role in beta-lactam antibiotic resistance[J]. J Bacteriol, 1999, 181(9): 2726-2732. [本文引用:1]
[6] DiGiuseppe PA, Silhavy TJ. Signal detection and target gene induction by the CpxRA two-component system[J]. J Bacteriol, 2003, 185(8): 2432-2440. [本文引用:1]
[7] Delihas N, Forst S. MicF: an antisense RNA gene involved in response of Escherichia coli to global stress factors[J]. J Mol Biol, 2001, 313(1): 1-12. [本文引用:1]
[8] 蔡加昌, 周宏伟, 陈功祥, 等. 一株耐碳青霉烯类的阴沟肠杆菌的KPC酶检测[J]. 中华医学杂志, 2008, 88(2): 135-138. [本文引用:1]