引用本文
程宁, 刘芳, 徐向红, 张丽娜, 白亚娜. 尿素干预膜KCC转运体对有核红细胞富集的实验研究[J].检验医学, 2015,25(11): 844-848
CHENG Ning, LIU Fang, XU Xianghong, ZHANG Lina, BAI Yana. Study on the enrichment of nucleated red blood cells through interfering membrane KCC by urea[J]. Labratory Medicine, 2015,25(11): 844-848  
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尿素干预膜KCC转运体对有核红细胞富集的实验研究
程宁1, 刘芳1, 徐向红1, 张丽娜1, 白亚娜2
1. 兰州大学生殖健康与出生缺陷研究中心、兰州大学甘肃省新药临床前研究重点实验室,甘肃 兰州 730000
2. 兰州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所,甘肃 兰州 730000

作者简介:程宁,男,1959年生,教授,主要从事生殖健康与出生缺陷防治研究。

基金:甘肃省“医药产学研”(01CX-03,02CX-04)基金项目
摘要
目的 通过对尿素干预K-Cl 同向转运体(K+/Cl- cotransporter,KCC)对红细胞(RBC)容积改变的观察,探讨建立有效富集分离有核红细胞(NRBC)方法。方法 测量在不同渗透压环境下、不同尿素浓度和作用时间后脐血RBC直径,建立改变细胞容积的最佳干预条件。流式细胞仪观察最佳条件下尿素干预脐血KCC转运体后富集NRBC的效果。结果 尿素浓度、渗透压条件及时间变化3种干预条件之间有交互作用( F=26.729, P<0.05)。在400 mM高渗环境下尿素干预10 min后可以使成熟RBC体积变小最明显( t=2.62, P<0.05)。干预脐血后1.065 g/mL密度介质离心下层RBC白膜层FNRBC富集量由12.2%升为69.9%( u=7.96, P<0.05),单个核上层FNRBC由7.15%降为2.00%( u=5.47, P<0.05)。结论 尿素干预脐血可以增加NRBC富集率达69.9%,较传统富集法增加了约5倍的富集量。
关键词: 有核红细胞; KCC转运体; 尿素; 调节性容量减少
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)11-0844-05
Study on the enrichment of nucleated red blood cells through interfering membrane KCC by urea
CHENG Ning1, LIU Fang1, XU Xianghong1, ZHANG Lina1, BAI Yana2
1. Center of Reproductive Health and Birth Defects, Gansu Province Key Laboratory of Preclinical Study for New Medicine, Lanzhou University, Gansu Lanzhou 730000, China
2. Institute of Epidemiology and Statistics, Public Health School, Lanzhou University, Gansu Lanzhou 730000, China
Abstract
Objective To establish an effective method for separating and enriching nucleated red blood cell (RBC) (NRBC) with observing the change of RBC volume through interfering K+/Cl- cotransporter (KCC) by urea.Methods The intervention condition of maximal change of cell volume was constructed by observing mature RBC diameter after interfering cord blood with different action time and urea concentration (400 mM, 200 mM and 100 mM) and different osmotic pressure. Under this intervention condition, the effect of NRBC's enrichment through interfering KCC by urea was observed by flow cytometry.Results There was an interaction among the intervention conditions of urea concentration, osmotic pressure and time change ( F=26.729, P<0.05). The volume of mature RBC decreased after intervention of both high osmotic pressure and 400 mM urea for 10 min( t=2.62, P<0.05). Under 1.065 g/mL centrifugation medium, the NRBC enrichment of underlayer white film increased from 12.2% to 69.9% ( u=7.96, P<0.05) after the urea intervention. The NRBC enrichment of upper white film reduced from 7.15% to 2.00% ( u=5.47, P<0.05).Conclusions The urea intervention can promote the rate of NRBC's enrichment to 69.9% , and it is about 5 times than traditional methods.
Keyword: Nucleated red blood cell; K+/Cl- cotransporter; Urea; Regulatory volume decrease

孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞(nucleated red blood cells, NRBC)进行基因分析是非常有前景的无创性产前诊断方法之一。目前相关富集分离方法中首先需要解决的是高效的富集方法, 本研究通过干预膜离子通道改变红细胞(RBC)容积, 探讨离心富集NRBC的效果, 为今后开展孕妇外周血中NRBC富集分离提供实验依据。

材料和方法
一、脐血标本

取20名健康孕妇足月分娩时脐静脉血, 用于脐血不同密度梯度离心和不同干预条件的探索。所有血样均用肝素抗凝。所有血样都在提供者知情同意的情况下采集, 并在24h内对采集的血样进行及时处理。

二、干预实验条件选择

尿素浓度分别为400、200、100 mM及对照组; 各尿素浓度组设置等渗液、高渗液及低渗液三种条件; 每组干预时间分别为5、10、20 min。取新鲜健康人脐血样本1份, 涂片后记录200个成熟RBC的直径。每小组的干预体系为6 mL。均采用3 mL脐血, 加入MgCl2液0.1 mL使干预条件富含Mg2+, Mg2+浓度均为100 mM。不同的渗透压液分别加入2 mL, 干预10 min, 然后加入不同浓度的尿素1 mL于37℃下同时进行干预。进行细胞干预后血涂片显微镜测微器记录200个成熟RBC直径, 对比干预前和干预后细胞直径差别。

三、干预脐血中NRBC

取肝素抗凝的新鲜脐血24 mL, 采用以上实验测定的使成熟RBC直径变化最大(细胞变为最小)的干预条件, 加入MgCl2液0.8 mL, 使其富含Mg2+的干预环境(Mg2+浓度100 mmol/L), 加入高渗液16mL混匀干预10 min, 然后加入尿素溶液8 mL混匀后同时干预10 min。将干预好的脐血分别缓缓加入到不同密度梯度的分离液面上, 梯度分别为1.065、1.077、1.087、1.099, 每个离心管均放入3 mL淋巴细胞分离液, 干预好的脐血以1∶ 2的比例加入6 mL, 共16个样本, 每个样本重复2管。同时做脐血干预前后的血涂片, 并分别计数200个成熟RBC的直径比较干预前后的差异。并同时设置未干预的阴性对照, 脐血以1∶ 1比例用PBS液稀释混匀, 其余操作均相同。

四、RBC内游离钙离子浓度测定

健康新鲜抗凝脐血5 mL制备RBC悬液。Fluo-3/AM负载和荧光测定:取2份RBC悬液各250 μ L, 1份悬液加入缓冲液250 μ L作为RBC干预前的对照管, 另1份加入10 μ L MgCl2, 166 μ L高渗液, 83 μ L尿素液后干预15 min后进行荧光剂负载。2管均加入Fluo-3/AM(0.5 μ mol/L), 充分混匀后在37℃下孵育45 min。采用激光共聚焦显微镜(Leica 德国)检测荧光强度。每份均照5张片子, 每张片子记录5个细胞的荧光强度, 得出平均值。

五、流式细胞仪计数NRBC

干预血样2 000 r/min(离心半径16.0 cm)离心20 min, 分别收集白膜状的单个核细胞层以及下层RBC层的白膜层, 加入氯化铵溶解RBC, 静置10 min, 1 000 r/min(离心半径16.0 cm)离心10 min。倾去上清液, 用PBS液重复洗涤1次, 800 r/min(离心半径16.0 cm)离心8 min, 计数收集细胞量(106)。异硫氰酸荧光素(FITC)标记特异性抗体CD71, 藻红蛋白(PE)标记血型糖蛋白(GPA)单抗, 采用FACSort型流式细胞仪(美国BD公司)检测, 细胞分析速率为500个/s, 每份标本至少分析检测5 000个细胞。先阴性样品测试, 再行待测标本测试。

六、统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件, 所得试验数据用 x̅± s表示, 采用两样本方差分析的t检验及多样本方差分析的Dunnett-t检验和Bonferroni检验进行统计学分析。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、尿素在不同渗透压下对RBC体积的影响

脐血在不同浓度尿素和不同渗透压下随时间细胞直径改变的数据见表1。

采用多个样本均数间的多重比较中的Dunnett-t检验, 使干预前直径与干预后的各样本对照比较; 其中未干预等渗液10 min、未干预低渗液干预10 min、100 mmol/L尿素低渗液干预10 min, 3组与干预前变化比较, 差异无统计学意义, P> 0.05。其余的干预样本与干预前的细胞直径变化比较, 差异均有统计学意义, P< 0.05。 统计学表明, 尿素浓度、渗透压及时间变化3种干预条件之间有交互作用, 其F值为26.729, P< 0.01; 采用方差分析中Bonferroni方法对样本间做两两比较, 样本总体来说组间和组内差异有统计学意义, F值为228.847, P< 0.05; 在高渗环境下, 400 mmol/L尿素干预10 min后可以使成熟RBC体积变小最明显, 与干预前的细胞直径比较差异有统计学意义, P< 0.05。检测不同浓度尿素干预和干预时间的RBC直径变化发现, 等渗时400 mmol/L尿素20 min干预后细胞直径最小; 在高渗时400 mmol/L尿素10 min干预后细胞直径最小; 在低渗时400 mmol/L尿素10 min干预后细胞直径亦最小。

表1 不同干预条件下随时间变化细胞直径的变化 (μ m, x̅± s)
二、RBC干预前后游离钙离子浓度变化的观察

干预前和干预后的RBC胞浆钙离子荧光负载有明显的变化(图1、2), 且经t检验分析, 尿素干预RBC后能够增加RBC胞浆Ca2+的浓度, P< 0.05(见表2)。

图1 干预前RBC胞浆Ca2+的浓度

图2 干预后RBC胞浆Ca2+的浓度

表2 干预前后脐血RBC胞浆Ca2+浓度比较
三、干预脐血后不同密度离心富集NRBC的结果

脐血在1.077密度介质下400 mmol/L尿素浓度干预后与未干预的单个核细胞层的CD71标记NRBC的百分比结果(见表3):1.077干预后的NRBC占30%(图3); 1.077未干预的NRBC占60.5%(图4)。脐血在不同浓度尿素条件下脐血样本1.077梯度下在单染(CD71-FITC)和双染(CD71-FITC/GPA-PE)标记下随尿素浓度增高NRBC百分比增大。表明尿素浓度在400 mmol/L时的干预可以使NRBC在下层富集量较大, 分别达到5.54%(图5)和40.5%(图6)。图6中横坐标FL1为荧光检测通道1(GPA), 纵坐标FL2为荧光检测通道2(CD71)。

图3 1.077干预NRBC检测结果

图4 1.077未干预NRBC检测结果

图5 CD71标记NRBC5.54%

图6 CD71/GPA标记NRBC40.5%

表3 1.077不同尿素浓度干预的下层NRBC数量 (%)
讨 论

应用廉价有效的手段富集分离出高纯度的胎儿NRBC, 是大范围临床产前基因诊断应用亟待解决的难题[1]。相关RBC离子通道干预的研究为胎儿NRBC的富集分离提供了可能的途径和方法。细胞容积的维持和调节是细胞基本的内环境稳定过程, 最终依赖细胞内渗透物含量的调节。当细胞遭到高渗液皱缩时, 细胞会激活溶液吸收机制以至原始体积的恢复。全部过程叫调节性容量增加(regulatory volume increase, RVI)。许多溶质运输体能完成RVI, 包括离子转运体如Na+-K+-2Cl-同向转运体(Na+/K+/2Cl- cotransporter, NKCC)、Na-H (Na-Li)交换蛋白(Na+/H+ exchanger, NHE)和Cl-/HCO3-交换蛋白[2]。而细胞膨胀会通过K-Cl 同向转运体(K+/Cl- cotransporter, KCC)调整性减少胞内KCl而使细胞缩小。这个过程叫调节性容量减少(regulatory volume decrease, RVD)。

选择尿素作为干预NRBC体积缩小的物质基于有关RBC膜K-Cl 同向转运体与体积的研究[3, 4]。Kaji D M和Gasson C[5]研究了尿素对K-Cl同向转运体的影响, 发现在人RBC中尿素通过浓度依赖性方式可逆性激活转运体。冈田酸解除了尿素的激活作用, 提示了尿素干预导致转运体的脱磷酸作用, 所以尿素的作用接近磷酸化-脱磷酸化步骤。鉴于高浓度的尿素在成熟、网织和幼稚RBC中调节细胞容积减少起了重要作用, 本实验选择了尿素作为干预NRBC体积缩小比重变大的物质[6]。尿素激活KCC需要有Mg2+参与, 所以有尿素干预的样本均给予Mg2+浓度100 mmol/L, 然后对尿素的浓度, 干预的渗透压环境及干预的时间作梯度进行摸索。根据文献表明尿素在200 mmol/L下可以有效激活KCC, 所以我们选择了400、200和100 mmol/L的浓度梯度。考虑尿素和不同的渗透压环境会发生协同的促进RBC体积缩小的作用, 所以选取每一种浓度的尿素分别处在等渗液、低渗液和高渗液的环境下在5、10、20 min不同干预时间下观察影响RBC体积变化最大的处理因素。结果表明无论哪种渗透压条件下, 均以400 mmol/L干预使细胞缩小最大且高渗液环境下尿素400 mmol/L、干预10 min RBC直径6.214 5± 0.794 2 μ m与干预前的直径7.814 25± 0.323 1 μ m相比RBC缩小最明显, 并且差异有统计学意义(P< 0.05), 同时表明尿素浓度和高渗液对RBC体积的缩小是有协同作用的。

常规的淋巴细胞分离液密度为1.077 g/mL, 以往的资料表明不同密度的分离介质离心后单个核细胞层获取的NRBC量不同, 但是很少有资料表明对密度离心后下层的研究。在本实验中摸索了富集NRBC密度分离介质的范围和不同尿素浓度干预NRBC后下层的富集效果及最佳干预条件。结果表明干预时1.077密度离心后单个核上层NRBC比未干预下降了30%, 说明NRBC在干预后部分脱离了单个核细胞上层降到下层RBC膜层。1.099密度介质单个核层虽然可以富集到更多的NRBC, 但RBC混杂较多, 因此进一步选择1.065、1.077、1.087、1.099 4个密度介质来研究干预后单个核层和下层的NRBC变化情况。流式检测结果显示在不同浓度尿素干预后下层NRBC增多, 且高浓度尿素有利于干预下层NRBC富集。

为观察不同密度的分离介质在富集NRBC的效果, 本实验选择抗CD71和GPA抗体作为NRBC的表面标记, 应用流式细胞仪检测完成了NRBC的识别。在尿素干预后给予1.065、1.077、1.087、1.099不同密度的分离介质离心, 并在离心后分别提取单个核细胞上层和RBC上层进行双阳性抗体标记流式细胞仪检测。由于在提取过程中均出现大量的RBC, 为了避免流式计数时的背景干扰, 我们对所有样本均用氯化铵溶血溶液行破解RBC的处理。未尿素干预的 1.065密度介质离心后下层的NRBC流式计数为12.2%, 干预后下层为69.9%, 干预比未干预富集率提高了将近6倍, 而且其余密度介质离心干预的下层均比未干预的下层富集率高, 随着密度梯度的增高提高的幅度降低, 说明尿素干预后确实使一部分NRBC沉于底层, 对NRBC的富集有一定的意义。我们的数据显示, 未干预组1.099密度介质离心后单个核细胞层NRBC达55.9%, 而且随密度介质的升高单个核层的NRBC会逐渐升高, 用传统的淋巴细胞分离液富集NRBC未必是最好的选择, 可能会因为NRBC的比重大于1.077而漏于底层造成NRBC的丢失。本实验最大的意义在于突破了用淋巴细胞分离液富集NRBC的传统[7], 而且应用了尿素作为有效的干预物质在密度梯度离心中更增加了NRBC的富集效率, 为临床富集NRBC提供了新的思路和手段。鉴于此方法建立是在没有前人可借鉴方法基础上开展实验, 此方法尚待于完善和进一步的实验研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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