引用本文
王蕾, 刘华, 王雯静, 张勤弢, 高锋. 中和确认试验对低水平HBsAg结果的确认及其应用评价. 25(1): 26-29
WANG Lei, LIU Hua, WANG Wenjing, ZHANG Qintao, GAO Feng. Application evaluation of the neutralization confirmatory test for the low level result of HBsAg determination. Labratory Medicine, 25(1): 26-29  
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中和确认试验对低水平HBsAg结果的确认及其应用评价
王蕾, 刘华, 王雯静, 张勤弢, 高锋
上海交通大学附属上海市第六人民医院检验科,上海 200233

作者简介：王蕾,女,1966年生,硕士,主任技师,主要从事临床免疫学检验及乙型肝炎病毒实验室指标的相关研究。

基金:上海市卫生局科研课题资助项目(2007066);
摘要
目的

应用中和确认试验对低水平乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的结果进行确认,并对确认结果进行综合评价。

方法

采用微粒子酶免疫荧光法(MEIA)检测乙型肝炎血清学标志物,对从中筛选出的118例低水平HBsAg阳性标本进行中和确认试验,并对确认结果进行评价。

结果

118例HBsAg低水平阳性(2<S/N<20)标本,经中和确认试验确认阳性111例(94.1%),阴性1例(0.8%),不确定6例(5.1%);受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,当MEIA检测HBsAg的S/N=4.76时,特异性可达100.0%,敏感性为69.4%。

结论

MEIA对低水平HBsAg检测的敏感性高,特异性好;当HBsAg的S/N≥5时,一般可以排除假阳性的可能,无需进一步做确认试验。

关键词: 乙型肝炎表面抗原; 低水平; 敏感性; 确认试验
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)01-0026-04
Application evaluation of the neutralization confirmatory test for the low level result of HBsAg determination
WANG Lei, LIU Hua, WANG Wenjing, ZHANG Qintao, GAO Feng
Department of Clinical Laboratory, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China
Abstract
Objective

To confirm and evaluate the results of low level hepatitis B surface antigen (HBsAg) by confirmatory assay.

Methods

Low level HBsAg positive samples (2<S/N<20) were detected by micropartical enzyme immunofluorescence assay (MEIA), and confirmed by HBsAg confirmatory assay.

Results

Among 118 low level HBsAg positive samples, 111 (94.1%) were confirmed, and only 1 sample (0.8%) was negative and 6 samples (5.1%) were uncertain. According to the receiver operating characteristic (ROC) curve , when the S/N was 4.76, the specificity was 100.0% and the sensitivity was 69.4%.

Conclusions

MEIA shows high sensitivity and specificity on low level HBsAg samples. When the S/N≥5, generally it is unnecessary to do the confirmatory assay.

Keyword: Hepatitis B surface antigen; Low level; Sensitivity; Confirmatory assay

乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)是乙型肝炎诊断及治疗评估的重要血清学标志物。随着检测方法和技术不断更新,许多实验室采用更先进的全自动微粒子酶免疫荧光法(micropartical enzyme immunofluorescence assay, MEIA)和化学发光法代替传统的酶联免疫吸附试验(ELISA),HBsAg检测的敏感性和特异性得到显著提高,特别是对部分患者低水平HBsAg阳性的检出率明显提高,有效避免了乙型肝炎病毒(HBV)感染的漏检以及输血、器官移植等过程中的安全隐患,但检测敏感性提高的同时这些低水平HBsAg检出是否存在假阳性?不同的检测方法对低水平HBsAg的检测能力到底存在多大的差异?是否所有低水平结果都要进行确认?这些问题长期以来一直困扰着临床实验室,为此我们对低水平HBsAg的血清样本进行确认,并对确认结果进行评价。

材料和方法
一、研究对象

2006年12月至2007年12月,采用AXSYM全自动酶免疫荧光分析仪检测17 405例门诊及住院患者HBV血清标志物,年龄1~88岁,其中HBsAg阳性1 940例,低水平HBsAg [2<S/N<20]130例,其中男82例,女48例,年龄9~84岁,所有结果均经过复检。

二、仪器和试剂

1. 仪器 AXSYM全自动酶免疫荧光分析仪购自美国雅培公司。

2. 试剂 HBV血清标志物检测试剂盒、HBsAg确认试验试剂盒以及HBsAg校准血清250 IU/mL(溯源至WHO HBsAg国际标准品,亚型ad.80/549) 购自美国雅培公司,HBsAg ELISA诊断试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。

三、方法

1. HBV血清标志物的检测 采用MEIA,严格按照AXSYM全自动酶免疫荧光分析仪的操作规程进行,所测结果均由仪器自动完成。HBsAg≥2 S/N时判为阳性。

2. HBsAg中和确认试验 实验操作严格按照雅培AXSYM仪器的操作规程,试剂盒中试剂A、试剂B、稀释液手工吸入样本杯中,放置在样本架1~3号位,4号位放置HBsAg定标液,5号位放置阳性质控,样本放置于6~10号位,所有样本均经10 000 r/min(离心半径为15.5 cm)离心10 min,取上清液检测。在样本中加入特异性针对HBsAg的人型中和抗体(试剂A),如果血清中存在HBsAg,则会被特异性的抗体中和。中和后的HBsAg不能结合包被于微粒子的乙型肝炎表面抗体(抗HBs)。同时测定同一样本加入中和抗体(试剂A)与未加入中和抗体(试剂B)的S/N值,分别用S/N(A)和S/N(B)表示,计算中和率。中和率公式与结果如下:中和率=[S/N(B)-S/N(A)]/[S/N(B)-S/N(index)]×100。每个样本都做原倍与1∶500稀释,样本稀释液使用确认试验专用稀释液。当S/N(B)≥1.5,判为反应性;反之无反应性。中和率>50%为阳性,反之为阴性。结果判定见 表1。

表1 中和确认试验结果判定

3. ELISA检测 实验操作严格按照说明书进行,采用双抗体夹心法原理检测HBsAg,用酶标仪读取各孔吸光度( A)值,样本( A)值/cut off值(S/CO值)≥1判为阳性。

四、统计学方法

计量资料以 x- ±s表示,使用SPSS 11.5统计软件进行受试者工作特征(ROC)曲线分析。

结果
一、MEIA检测HBsAg敏感性的评估

由于MEIA检测结果为S/N值,而非定量结果,故使用WHO溯源的HBsAg校准血清绘制标准曲线,计算相应HBsAg浓度。用专用稀释液将250 IU/mL校准血清进行一系列稀释,标准曲线浓度为10、4、2、1、0.5、0.2、0.1 IU/mL,空白对照为稀释液。重复5次,结果取平均值。以校准品浓度为横坐标,S/N值为纵坐标,绘制标准曲线,当S/N为2、5、10、20时,HBsAg浓度分别为0.095、0.405、0.932、2.033 IU/mL,见 图1。

图1 MEIA测定HBsAg标准曲线

二、低水平HBsAg的确认试验

在本研究130例低水平HBsAg (2<S/N<20)阳性样本中,有118例进行了确认试验,检测结果根据S/N值的不同分成3组,见 表2。

表2 低水平HBsAg确认试验结果
三、1例阴性和6例不确定结果的S/N值

经确认试验1例为阴性结果,6例为不确定结果,其S/N值在2.08~4.62之间,见 表3。

表3 1例阴性和6例不确定结果的S/N值
四、低水平HBsAg确认结果的ROC曲线分析

采用SPSS 11.5软件对低水平HBsAg确认试验结果进行ROC曲线分析,曲线下面积为0.807±0.049,见 图1。在确认试验中,不确定与阴性结果共7例,其S/N值在2.08~4.62之间,根据ROC曲线分析结果显示,当MEIA检测HBsAg的S/N=4.76时,特异性可达100.0%,敏感性为69.4%。因此一般而言只要S/N≥5,基本可以排除假阳性的可能。

图1 低水平HBsAg确认实验结果ROC曲线

五、ELISA对低水平HBsAg阳性的检出率

ELISA对97例经确认为低水平HBsAg阳性的样本总检出率仅为45.4%。其中2<S/N<5的阳性样本检出率仅为13.3%(4/30),对10<S/N<20的阳性样本检出率达80.0%(28/35),53例阴性结果中HBV DNA有8例为阳性,定量结果在1.33×103~4.86×104 IU/mL之间,见 表4。

表4 ELISA检测低水平HBsAg结果
讨论

HBV感染人群中有一部分血清HBsAg呈低水平存在,可能与HBV的清除、HBV变异、隐匿性乙型肝炎感染有密切的关系。我们对118例HBsAg检测结果 S/N值在2~20(浓度为0.1~2.0 IU/mL)的血清样本进行确认试验,确认结果阳性111例(94.1%),阴性1例(0.8%),还有6例(5.1%)为不确定结果;1例阴性和6例不确定结果的S/N值为2~5(浓度0.1~0.4 IU/mL)范围内;而当S/N>5时,确认结果的符合率达到100.0%(73/73),因此MEIA对低水平HBsAg检测不仅敏感性高,而且具有较高的特异性。通过确认试验的ROC曲线分析显示,曲线下面积达0.807±0.049,当S/N=4.76时,MEIA检测的特异性为100.0%,敏感性为69.4%,6例不确定与1例阴性样本HBsAg 的S/N值在2.08~4.62之间,因此我们认为采用AXSYM系统检测HBsAg出现低水平阳性结果时,只要S/N≥5,基本可以排除假阳性的可能,无需再做确认试验;而当2<S/N<5时,建议对这部分被检者进行复检和随访,如有可能最好进一步做确认试验进行确认。

应用WHO溯源的HBsAg标准血清建立标准曲线,标定MEIA检测HBsAg的浓度值。当检测结果S/CO>1(即S/N>2)时,HBsAg判定为阳性,通过标准曲线换算,MEIA检测敏感性可达0.095 IU/mL。采用ELISA对97例确认阳性的低水平HBsAg检测发现,当MEIA检测结果为2<S/N<10(0.1~1 IU/mL)时,ELISA的阳性率仅为25.8%,当10<S/N<20(1~2 IU/mL)时,ELISA与MEIA的符合率可达到80.0%,但ELISA仍有20.0%的漏检。分析两者检测结果差异的原因主要是检测方法学不同,此外还有各种人为因素的影响,如ELISA检测中加样的准确性、孵育温度、时间、洗涤的次数等[ 1]。故对于ELISA检测中的“灰区”结果,最好采用较为敏感和特异的方法进行复检,以免漏检,有条件的实验室可以用确认试验对结果进行确认。

值得注意的是,许多国内外报道称在HBV感染者中存在一部分隐匿性乙型肝炎感染的情况[ 2~ 5],隐匿性乙型肝炎的定义为HBV持续存在,肝内可检出病毒,但血清中不能检出HBsAg,病毒HBV DNA低水平或阴性。而对HBsAg结果的判定依赖于各种检测方法的敏感性,不同的检测方法其敏感性差异较大。本研究中,97例MEIA检测并确认为低水平HBsAg阳性的样本中,ELISA只检出44例阳性,53例阴性,其中8例存在HBV DNA低水平的复制,那么这53例由于方法学原因造成的阴性患者就有可能成为“隐匿性乙型肝炎”患者。因此部分隐匿性乙型肝炎可能并不是真正意义上的隐匿性感染,而是由于检测方法的局限而造成HBsAg的阴性,因此对于临床实验室而言,如果ELISA检测为“灰区”结果,最好采用更敏感而特异的方法进行复检,这样有利于提高HBsAg低水平阳性的检出率。

综上所述,在乙型肝炎血清标志物检测中,确实存在着一定比例的低水平HBsAg阳性者,应尽可能使用敏感性较高、特异性好的检测手段,提高这类乙型肝炎人群的检出率,从而有利于临床的早期干预,防止乙型肝炎的慢性进展,并能有效阻断HBV通过输血、器官移植、手术等途径的传播。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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