引用本文
夏骏, 邓菲, 胡志红, 刘芳, 王华林. 用液相芯片方法检测禽流感病毒H5N1亚型的研究. 2009, 24(9): 682-687
XIA Jun, DENG Fei, HU Zhihong, LIU Fang, WANG Hualin. Determination of Avian influenza virus H5N1 using MASA technology . Labratory Medicine, 2009, 24(9): 682-687  
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《检验医学》编辑部
用液相芯片方法检测禽流感病毒H5N1亚型的研究
夏骏1, 邓菲2, 胡志红2, 刘芳3, 王华林2
1. 浙江省人民医院检验中心,浙江 杭州 310014
2. 中国科学院武汉病毒所病毒学国家重点实验室,湖北 武汉 430071
3. 武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室,湖北 武汉 430072

作者简介:夏 骏,男,1980年生,硕士,技师,主要从事分子生物学研究。

通讯作者:王华林,联系电话:027-87198959。

摘要
目的

基于液相芯片(MASA)技术建立一种对H5N1亚型禽流感病毒进行快速检测的新方法。

方法

对GenBank上已有H5和N1核酸片段进行比对分析,设计简并引物和探针,将合成的探针与荧光编码微球进行偶联,建立检测方法。利用该方法检测H5N1亚型禽流感病毒和其他常见亚型(H1N1、H2N2、H3N2、H9N2)的标本。

结果

利用该方法能够特异性地检测出H5N1标本,检测信号具有较高荧光强度,对其他亚型标本的检测则为阴性结果。该方法对H5N1亚型RNA的最低检出量为10 pg。

结论

利用液相芯片技术研制的H5N1亚型禽流感病毒检测方法能够用于禽流感病毒H5N1亚型的快速、灵敏、特异性检测及鉴定。

关键词: 液相芯片技术; 禽流感病毒; H5N1亚型
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0682-06
Determination of Avian influenza virus H5N1 using MASA technology
XIA Jun1, DENG Fei2, HU Zhihong2, LIU Fang3, WANG Hualin2
1. Clinical Laboratory, Zhejiang Provincial People's Hospital, Zhejiang Hangzhou 310014, China
2. State Key Laboratory of Virology,College of Life Sciences,Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Hubei Wuhan 430071,China
3. State Key Laboratory of Virology, Wuhan University, Hubei Wuhan 430072,China
Abstract
Objective

To set up a new rapid method for the rapid determination of Avian influenza virus H5N1 basing on the multi-analyte suspension array(MASA) technology.

Methods

Sequence analysis and design of degenerate primers and specific probes were set in the comparison and analysis of H5 and N1 genes. In combination with MASA technology, these primers and probes were used for the determination of samples of H5N1 and other subtypes(H1N1,H2N2,H3N2 and H9N2).

Results

These specific primers and probes sets could be used for the rapid and specific determination of Avian influenza virus H5N1. High fluorescence intensity was detected in H5N1 sample but not in other samples of H1N1,H2N2,H3N2 and H9N2. The minimal amount as detected for H5N1 was 10 pg with this method.

Conclusions

MASA technology based determination method could be used for highl-specific, sensitive and rapid determination of Avian influenza virus H5N1.

Keyword: Malti-analyte suspension array technology; Avian influenza virus; H5N1 subtype

流感病毒引起的流行性感冒是常见急性呼吸道传染病之一, 由于流感病毒极易变异, 难以进行预前的免疫预防, 常常引起全国甚至世界性大流行。尤其近段时间世界上部分国家及我国部分地区出现了突发的禽流感及人禽流感H5N1亚型感染的病例[1], 且还有随时发生大规模流行的可能, 这些情况都迫切要求对禽流感病毒H5N1亚型做出早期、快速的实验室诊断。

液相芯片(multi-analyte suspension array, MASA)作为一种新型低密度基因芯片技术, 具有高通量、敏感性高、速度快的特点[2, 3]。本实验利用MASA技术, 设计针对H5N1血清亚型的特异性引物和探针, 通过使用荧光编码微球(beads)偶联的特异性检测探针对H5N1亚型进行快速的鉴定和分型。

材料和方法
一、标本的来源和准备

1. 标本的来源 本实验所使用的禽流感病毒常见毒株(H5N1、H1N1、H2N2、H3N2、H9N2)均由中国科学院武汉病毒研究所保藏中心提供, 并经过传统血清学方法鉴定和分型[4]。

2. RNA提取 RNA提取参照Trizol试剂使用说明进行。提取的核酸立即用于下步操作, 不立即处理的置于-80 ℃保存。

3. 主要试剂和仪器 引物和探针由上海基康生物科技有限公司合成; 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法试剂盒购自Qiagen公司; 羧基化微球(1.25× 107个/mL)购自Luminex公司; 偶联试剂1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)购自Pierce公司; 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、液相杂交试剂氯化四甲铵(TMAC)购自Sigma公司、链霉素-藻红蛋白(SA-PE)购自Molecular Probes公司; 多功能流式点阵仪(Luminex 100TM)购自Luminex公司。

二、序列分析、引物探针的设计合成

从NCBI的GenBank上下载已有A型流感病毒H5和N1片段核酸序列, 筛选出所需的完整序列。利用生物信息学软件(Bioedit 7.0.1)对序列进行比对分析, 根据核酸的同源性将这些核酸序列分成不同的组别。

本实验中对H5和N1亚型分别分成2个分析组:H5-1和H5-2、N1-1和N1-2。对于每个组, 分析并找出保守序列, 根据保守序列设计引物和探针。由于单个核酸变异比较多, 我们对变异位点进行简并性设计。由于所使用的探针需要和羧基修饰的荧光编码微球进行偶联, 所有探针都需要进行5'端的氨基化修饰。

设计引物时, 在所有正向引物和反向引物的5'端各加入一段独特序列, 即与所有已知的流感病毒序列及GenBank中保存的数据没有同源性的序列, 以便用于进行第2轮扩增反应。5'端各加入的独特序列分别为Uni-forward:5'-TACAGTCGGTCGCGTGCCTC和 Uni-reverse:5'-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG。

第2轮扩增反应使用上面的这2段序列作为上下游引物(Uni-forward和Uni-reverse), 其中下游引物Uni-reverse的5'端用生物素(biotin)标记。

引物和探针序列见表1。

表1 本实验中设计的引物和探针
三、RT-PCR和PCR

1. 应用单对引物的扩增反应 设计2轮PCR反应。第1轮反应即利用特异性引物从H5N1病毒RNA中扩增目的片段的RT-PCR步骤。其反应体系为25 μ L, 其中5× 缓冲液5 μ L、dNTP(10 mmol/L)1 μ L、酶混合物1 μ L、RNA酶抑制剂5 U、正向和反向引物各0.75 μ L(20 pmol/μ L)、RNA模板1 μ L, 加水补足25 μ L体系。使用PTC-200 PCR仪, 条件为逆转录50 ℃ 30 min, 变性95 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 进行35个循环, 最后72 ℃延伸5 min。

第2轮反应是利用Uni-引物以第1轮反应产物为模板进行的PCR反应。反应体系为50 μ L, 其中10× 缓冲液5 μ L, dNTP(10 mmol/L)1 μ L, TaqDNA聚合酶1 U, Uni-forward 1 μ L, Uni-reverse 1.5 μ L, 加入前一步RT-PCR反应产物1 μ L, 加水补足50 μ L体系。反应条件为变性95 ℃ 10 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 进行35个循环, 最后72 ℃延伸5 min。反应产物置4 ℃待杂交检测。

2. 应用混合引物进行的扩增反应 将针对H5N1亚型的4对特异性引物混合(每条引物0.6 μ mol), 2轮扩增反应后对产物杂交检测。

四、MASA的制备

1. 探针与微球偶联 参照文献[5, 6]方法将探针偶联到不同荧光编码的微球上, 混合偶联好探针的微球, 用1.5× TMAC稀释至每种微球的浓度为150个/μ L, 4 ℃避光保存。

2. 偶联效果的评价 设计1条针对探针的完全互补的寡核苷酸序列(该序列的5'端标记有生物素)与偶联微球进行杂交, 以确定我们使用的偶联及杂交条件: 50 μ L杂交反应体系中加入该寡核苷酸序列1 μ L (20 pmol/μ L), 调整各种条件, 检测杂交荧光强度值。

3.扩增产物的液相杂交 将产物与混合微球杂交, 总体积为50 μ L, 其中混合微球33 μ L, PCR产物5 μ L, 加入三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE)补足体积。杂交反应条件:96 ℃变性5 min后, 52 ℃杂交15 min。加入SA-PE 52 ℃杂交5 min, 上机检测。

4.多功能流式点阵仪(Luminex 100TM)的设置 设置仪器参数为Events=100; Min event=20。Gate value的确定:使用Luminex 100TM 直接读取本实验中所使用未偶联探针的微球, 根据仪器读取的峰值确定门值(gate value)大小。

5.标本检测与结果判断 用已有的禽流感病毒毒株(H5N1、H1N1、H2N2、H3N2、H9N2)为标本进行方法学的特异性和敏感性验证。阳性判断以检测荧光强度值100为界。

结 果
一、利用RT-PCR和PCR对引物进行检验和评价

利用设计的引物和方法对所有标本进行扩增后采用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 对设计的引物进行检验和评价。见图1。

图1a为H5N1亚型标本的单对引物和混合引物RT-PCR产物结果, 其中H5-2组中无扩增产物, 其他组中有特异性扩增产物。在混合引物扩增产物中, 出现了3条特异性条带和2条非特异性条带。

应用混合引物对其他所有标本进行2轮扩增反应, 经电泳分析没有发现特异性条带, 结果见图1b, 证明所设计的引物在所检测的样本范围内具有较好的特异性。

图1 各种标本扩增产物

二、偶联及杂交条件的优化

偶联体系受探针量、EDC量和微球数量影响, 而液相杂交反应时杂交温度对杂交效果也非常重要。经大量实验条件优化后发现, 当使用50 μ L微球, 加入0.04 nmol/L探针和0.5~2.5 mg/mL EDC, 杂交温度设定为52 ℃时, 得到的杂交荧光强度最强, 能达到15 000(数据未显示)。

三、门值的确定

为减少因使用不同批次微球造成的结果差异, 本实验中使用Luminex 100TM 直接读取实验中荧光微球的大小数值, 重复读数3次求得平均值见图2a, 从而确定本实验门值=9 294~18 441。

图2 Luminex100TM检测结果

四、病毒标本的检测评价

1. 单组特异性引物扩增产物的检测分析 为了评价实际样本检测中用这些简并引物扩增出的产物和特异性探针微球检测之间的对应关系, 我们对H5N1样本进行了交叉检测, 即分别用1组特异性引物对病毒样本进行扩增, 扩增产物用H5-1、H5-2、N1-1、N1-2混合荧光微球探针进行检测。结果显示, H5-1组探针微球检测H5-1引物扩增产物检测到较高的荧光读数(1 676.22), N1-2组探针微球检测N1-2引物扩增产物检测到较高的荧光读数(3 054.13)。但同时也发现用H5-2组微球也能检测到H5-1引物的扩增产物, 但检测到荧光读数为757.91, 略低于H5-1组微球, 说明H5亚型的2个分组间具有交叉反应现象; 用N1-1组微球也能检测到N1-2引物的扩增产物, 但检测到荧光读数为216.29, 远低于N1-2组探针微球检测到荧光读数3 054.13, 说明N1基因的2个组间也具有交叉反应现象。见表2。

表2 特异性引物扩增产物的检测结果

2. 多种血清亚型病毒样本的特异性分析 用所设计的引物及探针分别对H5N1样本和其他几种常见血清亚型样本进行特异性评价。在对H5N1亚型样本的检测中发现4种微球都检测到了较高荧光读数的阳性结果; 对H1N1亚型样本的检测中只有N1-2号微球有较高的荧光读数, 平均荧光强度值为185.07, 见图2; 而对其他亚型样本的检测则各种微球检测的荧光强度都较低, 判定为阴性结果。这些检测结果与预期一致, 说明本研究中所设计探针组合能够特异性的用于禽流感H5N1亚型的检测。见表3。

表3 多种血清亚型病毒样本检测结果

3. 对H5N1样本进行检测敏感性分析 对H5N1亚型RNA样本进行系列稀释, 然后用混合引物进行RT-PCR和PCR扩增, 见图1c, 扩增的结果分别用特异性探针进行判读, 检测结果见表4。检测信号的强度随着RNA样本量的递减逐渐递减, 在10 pg的样本中, 只有H5-1和N1-2探针能够检测出大于100的荧光强度值, 说明对H5N1亚型RNA的检测敏感性最低可达到10 pg。

表4 敏感性检测试验
讨 论

流感病毒检测主要分成四大部分:病毒的培养分离、血清学诊断、病毒抗原检测、病毒核酸检测, 其中病毒的培养分离、血清学检测和分型是常规方法, 但此类方法由于花费时间比较长, 无法快速对流感病毒进行检测和分型[7]。在病毒核酸检测和分型中, 出现了很多快速特异的方法[8, 9]。

MASA技术是一种新型基因芯片技术, 该技术是把微小的乳胶颗粒分别染成上百种不同的荧光色, 应用时把针对不同检测物的乳胶颗粒混合后再加入微量样本, 在悬液中与微粒进行特异性地结合, 结果可以通过瞬间激光判读后用计算机以数据的形式记录下来。该技术已经在基因分型、组织分型、感染性疾病的检测等方面得到广泛应用。

在本实验中我们设计了针对H5N1血清亚型的4对特异性引物和探针, 使用4种不同荧光编码的微球, 利用MASA技术对H5N1亚型的鉴定和分型进行了初步尝试。

我们对下载的所需基因序列进行了大量分析, 包括同源性比对和保守区域的寻找, 并且确定了保守区域, 特别是设计探针所在的区域在被检测亚型中具高度保守性, 从而最大限度的避免了实际应用中可能出现的假阳性和假阴性结果。

在利用Luminex 100TM进行的检测中, 我们发现H5-1组的扩增产物和H5的2种探针都有杂交, 利用软件分析得知, 这2组PCR产物和探针间存在一定的序列互补, 只是由于配对的碱基数目存在着差异从而在荧光强度上存在差别, 同样N1-2组的扩增产物与N1-1的检测探针也有部分互补。虽然存在序列互补情况, 但由于该方法是根据H5和N1 2组结果来鉴定H5N1亚型, 因此对样本检测结果的判定没有影响。对该结果分析, 又可以进一步说明这次检测的样本与H5-1、N1-2组包括的核酸序列有较高同源性, 有助于标本溯源分析。该方法对H5N1亚型RNA的最低检出量是10 pg, 而电泳结果无明显条带, 证明方法有较高的敏感性。

在特异性试验中用N1-2探针检测H1N1样本有较高的荧光强度, 而用H5-1和H5-2探针检测皆为阴性, 说明此样本为非H5N1亚型的其他具N1基因的H亚型。对其他非H5N1亚型的检测结果都为阴性, 进一步说明该方法有较好的特异性。

由于引物探针的设计是针对目前GenBank上所有H5和N1核酸序列, 而我们能够利用的研究样本来源有限, 所以还可能存在着H5阳性、N1阴性检测结果, 还需要在实际检测中大规模应用。如果进一步研制出针对各种常见流感亚型的检测试剂盒, 会具有更大价值。而针对实际检测, 由于此方法从样本RNA的提取到最后结果的判断可以在一个工作日(8 h)内完成, 除具有高敏感性和特异性以外, 还具有检测速度快的特点, 因此该方法在禽流感病毒的快速诊断中将会发挥重要的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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