引用本文
王翠玲, 李茹冰, 王增松, 夏书奇, 段祥, 谢飞群, 曾振飞, 揭燕, 傅泳航, 张宜俊. HBsAg联合rhIL-12对慢性乙型肝炎患者PBMC诱生IFN-γ的作用. 2009, 24(9): 671-675
WANG Cuiling, LI Rubing, WANG Zengsong, XIA Shuqi, DUAN Xiang, XIE Feiqun, ZENG Zhenfei, JIE Yan, FU Yonghang, ZHANG Yijun. Combination of HBsAg and rhIL-12 induces the production of IFN-γ of PBMC from chronic hepatitis B patients in vitro. Labratory Medicine, 2009, 24(9): 671-675  
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HBsAg联合rhIL-12对慢性乙型肝炎患者PBMC诱生IFN-γ的作用
王翠玲1, 李茹冰2, 王增松1, 夏书奇1, 段祥1, 谢飞群1, 曾振飞1, 揭燕1, 傅泳航2, 张宜俊1
1. 广州市恺泰生物科技有限公司,广东 广州 510620
2. 解放军第458医院检验科,广东 广州 510602

作者简介:王翠玲,女,1982年生,学士,技师,主要从事基因工程细胞因子的研究。

通讯作者:张宜俊,联系电话:020-87535885。

摘要
目的

确认重组人白细胞介素12(rhIL-12)联合乙型肝炎表面抗原(HBsAg)可增强慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)对HBsAg产生特异性细胞免疫应答,探讨rhIL-12联合HBsAg作为治疗型乙型肝炎疫苗的应用前景。

方法

取8名正常人和16例慢性乙型肝炎患者的PBMC,分别用不同浓度的HBsAg、rhIL-12单独体外刺激,再用HBsAg联合rhIL-12(0.01、0.1和1.0 ng/mL)刺激患者PBMC,72 h后用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清中的γ干扰素(IFN-γ)。

结果

HBsAg或rhIL-12单独刺激仅产生低水平的IFN-γ,联合使用HBsAg和rhIL-12刺激后,患者PBMC产生的IFN-γ平均水平显著高于单独使用HBsAg或rhIL-12( P均<0.05)。HBsAg(0.5 μg/mL)联合rhIL-12(0.01、0.1和1.0 ng/mL)刺激患者PBMC产生的IFN-γ与rhIL-12的浓度之间呈明显的量效关系。

结论

HBsAg和rhIL-12联合刺激乙型肝炎患者PBMC,通过产生高水平IFN-γ激活乙型肝炎患者特异性细胞免疫。

关键词: 乙型肝炎表面抗原; 重组人白细胞介素12; 外周血单个核细胞; 细胞免疫; γ干扰素
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0671-05
Combination of HBsAg and rhIL-12 induces the production of IFN-γ of PBMC from chronic hepatitis B patients in vitro
WANG Cuiling1, LI Rubing2, WANG Zengsong1, XIA Shuqi1, DUAN Xiang1, XIE Feiqun1, ZENG Zhenfei1, JIE Yan1, FU Yonghang2, ZHANG Yijun1
1. The Kaitai Bio-Tech Company Limited,Guangdong Guangzhou 510620, China
2. The 458th Hospital of People's Liberation Army,Guangdong Guangzhou 510602, China
Abstract
Objective

To confirm the enhancing effect of recombinant human interleukin 12 (rhIL-12)-hepatitis B surface antigen (HBsAg) combination on the cellular immune response to HBsAg of peripheral blood mononuclear cell(PBMC) from chronic hepatitis B patients in vitro. To investigate the foreground of HBsAg-rhIL-12 combination being a novel therapeutic hepatitis B vaccine.

Methods

PBMC were prepared from the peripheral blood of 8 healthy subjects and 16 chronic hepatitis B patients and cultured in the presence of variant concentration HBsAg or rhIL-12.The PBMC were cultured in the presence of variant concentration HBsAg and rhIL-12(0.01,0.1 and 1.0 ng/mL). The level of interferon-γ(IFN-γ) in culture supernatants which harvested at 72 h were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).

Results

Low levels of IFN-γ were observed when PBMC from healthy subjects and chronic hepatitis B patients were stimulated with HBsAg or rhIL-12 alone.The IFN-γ levels in culture supernatants of PBMC from chronic hepatitis B patients with HBsAg-rhIL-12 combination increased significantly( P<0.05).When HBsAg(0.5 μg/mL)plus rhIL-12(0.01,0.1 and 1.0 ng/mL)stimulated the PBMC from chronic hepatitis B patients,the concentration of rhIL-12 was with the dose-dependant to produce IFN-γ.

Conclusions

rhIL-12 combined with HBsAg can promote the specific cellular immune response to the Hepatitis B virus by the enhancement of IFN-γ production.

Keyword: Hepatitis B surface antigen; Recombinant human interleukin 12; Peripheral blood mononuclear cell; Cellular immunity; Interferon-γ

目前, 慢性乙型肝炎的临床治疗存在着很多不足之处, 常用的抗病毒药物如核苷类似物和干扰素只能抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制, 不能彻底清除人体内的HBV, 而乙型肝炎疫苗主要以预防为主, 几种治疗型疫苗目前正处于研究阶段。有研究表明, 急性自限性乙型肝炎患者主要通过多特异性多克隆细胞免疫清除HBV, 其中特异性细胞毒性T细胞(CTL)在HBV清除方面发挥重要作用。CTL清除病毒的主要机制是通过细胞接触和释放细胞因子[主要是γ 干扰素(IFN-γ )和肿瘤坏死因子α (TNF-α )]激活肝细胞自身抗病毒机制, 抑制HBV DNA复制和促进HBV RNA降解[1]。动物实验证实IFN-γ 能抑制HBV的表达和复制[2]。慢性乙型肝炎患者HBV特异性免疫功能降低和免疫耐受, 使其自身不能完全清除HBV, 但其体内对HBV抗原产生应答的细胞主要是Th1型细胞[3], 因此应用有效的免疫佐剂与HBV特异性抗原组成治疗型乙型肝炎疫苗, 提高慢性乙型肝炎患者HBV特异性细胞免疫功能, 对于HBV的彻底清除十分重要。

白细胞介素12(IL-12)在免疫网络中占有十分重要的地位, 其能够显著诱导Th1型细胞免疫[4, 5], 增强CD8+ T细胞的细胞毒性[6], 并抑制Th2型细胞免疫[7], 这些特性使之在抑制HBV复制的过程中发挥重要作用, IL-12具有促进T细胞活化、增殖、裂解的效应功能, 有可能成为一个非常有效的免疫增强剂以辅助CD8+ T细胞的免疫反应。

本研究以重组人IL-12(rhIL-12)与HBV表面抗原(HBsAg)联合应用, 研究其对慢性乙型肝炎患者HBV特异性细胞免疫功能的影响。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象 根据2005年中国《慢性乙型肝炎防治指南》的乙型肝炎诊断标准[8], 连续收集2008年3月至2008年11月间广州空军医院肝病中心门诊的慢性乙型肝炎患者16例, 其中HBV e抗原(HBeAg)阳性、HBeAg阴性(非活动性HBsAg携带者)慢性乙型肝炎患者各8例, 男14例, 女2例, 年龄17~49岁, 平均31.17岁。所有患者接受正规抗病毒治疗> 1年, 并排除甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染和其他原因(药物、酒精、中毒)造成的急慢性肝损害。8名健康志愿者作为对照, 对照组全部接种过重组HBsAg疫苗, 血清中除了HBV s抗体(抗HBs)阳性外, 其余HBV血清学指标均为阴性。

2. 主要试剂 rhIL-12(广州市恺泰生物科技有限公司, 批号20080611), 重组HBsAg疫苗(深圳康泰生物制品股份有限公司), RPMI-1640、Hanks'液和胎牛血清(GIBCO, 美国), Ficoll淋巴细胞分离液(上海华精公司), 抗人CD3(eBioscience, 美国), 人IFN-γ 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒和四甲基联苯胺(TMB)底物显色剂(BD-Pharmingen, 美国)。

3. 主要设备 SW-CJ-2F型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司), CO2培养箱 (SANYO, 日本), LXJ-Ⅱ 型离心机(上海医用分析仪器厂), Multiskan MK3酶标仪、XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。

二、检测方法

1. 预试验 联合应用的HBsAg与rhIL-12最佳剂量选择:(1)人外周血单个核细胞 (PBMC)的分离:抽取1名健康志愿者和1例慢性乙型肝炎患者静脉血10 mL, 肝素抗凝。Hanks'液等体积稀释, 用 Ficoll进行密度梯度离心 [8 ℃, 2 000 r/min(离心半径为18 cm) 离心20 min]获取PBMC, 充分洗涤后, 用 RPMI-1640完全培养液调整 PBMC浓度为 2 × 106/mL; (2)HBsAg最佳剂量选择按以下刺激物浓度分组:阴性对照为培养液; HBsAg(5、 2.5、 1.25、 0.625、0.313、 0.156和0.078 μ g/mL); 1 ng/mL rhIL-12; HBsAg(5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156和0.078 μ g/mL)联合1 ng/mL rhIL-12; 阳性对照为0.2 μ g/mL抗人CD3; (3)rhIL-12最佳剂量选择按以下刺激物浓度分组:阴性对照为培养液; 0.5 μ g/mL HBsAg; rhIL-12(0.01、0.1、1.0和5.0 ng/mL); 0.5 μ g/mL HBsAg联合rhIL-12(0.01、0.1、1.0和5.0 ng/mL); 阳性对照为0.2 μ g/mL抗人CD3。

细胞培养板(Gibco)每孔中含细胞悬液及相应浓度刺激物各100 μ L , 各刺激物浓度均设 3个复孔, 置 37 ℃ 5%CO2 培养箱培养 72 h, ELISA测定培养上清中IFN-γ 的浓度。

2. HBsAg(0.5 μ g/mL)联合rhIL-12诱导慢性乙型肝炎患者和正常人PBMC中IFN-γ 的产生 所有研究对象按预试验方法分离PBMC, 依据预试结果选用HBsAg(0.5 μ g/mL), rhIL-12最佳剂量为0.01、0.1和1.0 ng/mL。按以下刺激物浓度分组:阴性对照为培养液; 0.5 μ g/mL HBsAg; rhIL-12(0.01、0.1和1.0 ng/mL); 0.5 μ g/mL HBsAg联合rhIL-12(0.01、0.1和1.0 ng/mL); 阳性对照为0.2 μ g/mL抗人CD3。PBMC与刺激物共温的条件和时间以及上清液中IFN-γ 含量测定方法同预试验。

三、统计学方法

检测数据用 x̅± s表示, 采用SPSS 13.0软件进行t检验分析, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、HBsAg与rhIL-12联合应用中HBsAg最佳剂量选择

HBsAg联合rhIL-12(1.0 ng/mL)诱导健康人PBMC中IFN-γ 的产生具有明显量效关系, 在一定范围内随HBsAg浓度下降(2.5~0.625 μ g/mL), IFN-γ 产生增加, 最佳的浓度范围为0.625~0.078 μ g/mL, 据此在后续实验中选择0.5 μ g/mL浓度的HBsAg。而单独应用HBsAg组基本不能诱导正常人PBMC产生IFN-γ , 与阴性对照组相似。见图1。单独应用rhIL-12(1.0 ng/mL)仅产生微弱的刺激作用, 阳性对照0.2 μ g/mL抗人CD3显示强诱生IFN-γ 作用。

图1 HBsAg联合rhIL-12(1.0 ng/mL)诱导健康人PBMC产生IFN-γ 量效关系

二、HBsAg与rhIL-12联合应用中rhIL-12最佳剂量选择

HBsAg(0.5 μ g/mL)联合rhIL-12诱导健康人PBMC中IFN-γ 的产生具有明显的量效关系, 在一定范围内随rhIL-12浓度的升高(0.1~1.0 ng/mL), IFN-γ 产生增加, 最佳浓度范围为0.1~5.0 ng/mL。单独应用rhIL-12也产生刺激作用。见图2。

图2 HBsAg(0.5 μ g/mL)联合rhIL-12诱导健康人PBMC产生IFN-γ 量效关系

三、HBsAg联合rhIL-12在体外增强慢性乙型肝炎患者PBMC产生特异性IFN-γ

用0.5 μ g/mL HBsAg或1.0 ng/mL rhIL-12单独刺激乙型肝炎患者或健康人的PBMC时, 发现仅有少量IFN-γ 产生, 而用HBsAg联合rhIL-12刺激时, 可以观察到所有患者(16例)和健康人(8名)都能产生IFN-γ , 而且IFN-γ 的平均水平显著高于单独使用HBsAg组和rhIL-12组(P< 0.05)。以HBsAg联合rhIL-12刺激, 乙型肝炎患者所产生的IFN-γ 的平均水平高于健康对照组, 但差异无统计学意义。见图3。

图3 HBsAg联合rhIL-12体外增强慢性乙型肝炎患者PBMC产生特异性IFN-γ

四、0.5 μ g/mL HBsAg联合rhIL-12诱导慢性乙型肝炎患者特异性IFN-γ 产生的剂量依赖性

采用0.5 μ g/mL HBsAg单独或联合rhIL-12(0.01、0.1和1.0 ng/mL)刺激慢性乙型肝炎患者和健康人PBMC, 发现患者各浓度组都有明显的IFN-γ 水平上升, 而且各浓度组之间IFN-γ 的平均水平之间差异有统计学意义(P< 0.01), 即使低浓度rhIL-12与HBsAg协同, 产生的IFN-γ 平均水平也明显高于单用HBsAg组(P< 0.01), 而且IFN-γ 水平与rhIL-12浓度呈明显的剂量依赖性。健康对照组尽管IFN-γ 升高的平均水平不如乙型肝炎患者, 但各浓度组之间差异亦有统计学意义(P< 0.01)。见图4。

图4 0.5 μ g/mL HBsAg联合rhIL-12诱导产生慢性乙型肝炎患者特异性IFN-γ 与rhIL-12的剂量依赖性

讨 论

HBV感染是一个广泛威胁全人类健康的问题, 尽管大部分患者为急性自限性感染, 能够完全康复, 但仍有很多感染者发展成为慢性乙型肝炎, 并最终导致肝硬化和肝癌。导致HBV慢性感染的病理机制仍不清楚, 但可以肯定的是其中一个重要的原因就是机体对病毒的免疫应答能力不足, 针对HBV的特异性细胞免疫应答低下, 甚至呈现对HBV的免疫耐受状态[9~11]。大量研究表明, T细胞免疫应答是机体清除HBV感染的基本机制[12]。IL-12调节T细胞分化方向, 增强细胞免疫并放大Th1型应答。在转基因鼠模型上的试验证明IL-12可以诱生IFN-γ , 抑制病毒复制[13]。而且用IFN-α 治疗慢性乙型肝炎时, 病毒清除伴随着血清IL-12水平的升高[14]。Schlaak等[9]报道IL-12和HBV抗原共同刺激患者PBMC后, 能够观察到HBV诱导的非Th1型细胞因子向Th1型转变。

本研究中实验数据显示, HBsAg仅能诱导慢性乙型肝炎患者PBMC产生非常低水平的免疫应答, 表现为产生低水平的IFN-γ 。有报道认为HBsAg是抗炎性细胞因子白细胞介素10(IL-10)的诱导者, 因此单独使用HBV抗原可能优先产生抗炎反应, 从而使免疫反应无效[9]。实验中HBsAg联合rhIL-12后, 大部分慢性乙型肝炎患者的PBMC产生大量IFN-γ , 与单用HBsAg刺激差异有统计学意义(P< 0.05)。这意味着患者的T细胞具有对HBV抗原产生强烈应答的能力, 但前提条件是要有抗原递呈细胞(APC)分泌的IL-12存在, 即以IL-12作为免疫增强剂放大T细胞对乙型肝炎特异性抗原的免疫应答能力。大量研究结果证明, HBV患者或HBV转基因鼠的树突状细胞(DC)都受到损伤[15~18], 这或许是乙型肝炎患者不能自行产生足够的IL-12和IFN-γ 来清除病毒的主要原因之一。

既然乙型肝炎患者的PBMC产生的IL-12不足, 本研究直接给予外源的rhIL-12, 旨在增强细胞免疫功能, 期望能够在一定程度上打破免疫耐受。仅0.1 ng/mL rhIL-12就能促使产生大量HBsAg特异性IFN-γ , 同时高、中、低3个浓度rhIL-12和特异性HBV抗原协同都能够诱导乙型肝炎患者PBMC产生IFN-γ , 且产生的IFN-γ 水平和rhIL-12浓度之间有明显的量效关系。这表明HBV患者的抗原特异性细胞免疫的激活不仅需要第一信号特异性抗原, 还需要细胞因子IL-12的协同作用。外源性IL-12的加入, 使抗原特异性T细胞活化并产生高水平的IFN-γ , 这在HBV清除过程中将起到非常重要的作用。

综上所述, 若将IL-12与HBsAg联合组成HBV特异性治疗型疫苗, 期待其能激活乙型肝炎患者特异性细胞免疫, 这对于HBV感染的治疗可能是非常有效的途径。

The authors have declared that no competing interests exist.

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