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赵建幸, 罗雪美, 詹一鸣, 陈波, 朱鼎良. 高效液相色谱——紫外、荧光双检测器同时测定人尿中犬尿氨酸和犬尿喹啉酸. 2009, 24(9): 659-662
ZHAO Jianxing, LUO Xuemei, ZHAN Yiming, CHEN Bo, ZHU Dingliang.. Simultaneous determination of kynurenine and kynurenic acid in human urine by HPLC with ultraviolet and fluorescence detector. Labratory Medicine, 2009, 24(9): 659-662  
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高效液相色谱——紫外、荧光双检测器同时测定人尿中犬尿氨酸和犬尿喹啉酸
赵建幸, 罗雪美, 詹一鸣, 陈波, 朱鼎良
上海交通大学医学院附属瑞金医院上海市高血压研究所,上海 200025

作者简介:赵建幸,男,1955年生,高级工程师,主要从事仪器分析工作。

摘要
目的

建立高效液相色谱(HPLC)同时测定人尿中犬尿氨酸(KYN)和犬尿喹啉酸(KYNA)方法。用KYNA/KYN比值评价人体犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)活性。

方法

采用HPLC测定KYN、KYNA,分析柱为安捷伦HC C18反相色谱柱;流动相为10 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液∶7%乙腈 =93∶7;流速1 mL/min;检测器波长:紫外365 nm,荧光344 nm(激发)/398 nm(发射)。

结果

KYN和KYNA保留时间分别为6.9和11.5 min。水溶液标准与标准加入工作曲线斜率差异无统计学意义 (KYN: P= 0.406 8;KYNA: P= 0.646 2)。KYN和KYNA的平均回收率分别为98.74%±7.53 % 、95.17%±8.17%;稳定性试验的变异系数( CV)分别为3.35 % 和0.88 %;精密度 CV分别为2.73 % 和2.79 %;最低检测限分别为0.4和0.2 μmol/L。30份健康成年人尿样的KYNA/KYN比值为2.45±1.54。尿中KYNA与 KYN含量呈正相关关系( r2 = 0.375 8, P< 0.001)。

结论

测定方法灵敏、准确、稳定。KYNA/KYN比值评测KAT活性具有简便、实用等特点,可用于相关疾病的临床辅助诊断和基础研究。

关键词: 犬尿氨酸; 犬尿喹啉酸; 犬尿氨酸氨基转移酶; 高效液相色谱
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0659-04
Simultaneous determination of kynurenine and kynurenic acid in human urine by HPLC with ultraviolet and fluorescence detector
ZHAO Jianxing, LUO Xuemei, ZHAN Yiming, CHEN Bo, ZHU Dingliang.
Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To establish the high performance liquid chromatography (HPLC) method for determining kynurenine (KYN) and kynurenic acid (KYNA) in human urine simultaneously. To evaluate the activity of human kynurenic aminotransferase (KAT) with KYNA/KYN ratio.

Methods

The levels of KYN and KYNA were determined by HPLC. Analytical column: Agilent HC C18 column. Mobile phase: a buffer solution of 10 mmol/L sodium acetate-acetic acid ∶7% acetonitrile=93 ∶7. Flow rate: 1 mL/min. Wavelengths of detectors: ultraviolet, 365 nm; fluorescence, excitation 344 nm/emission 398 nm.

Results

The retention times of KYN and KYNA were 6.9 and 11.5 min respectively. There was not significant difference between the slopes of linear regression curves of aqueous and urine-matched standard-addition curves (KYN: P=0.406 8; KYNA: P=0.646 2). The average recoveries of KYN and KYNA were 98.74%±7.53% and 95.17%±8.17%. The coefficients of variation ( CV) of KYN and KYNA were 3.35 % and 0.88 % for stability test,2.73 % and 2.79 % for precision test. The lowest detection limit of the method was 0.4 μmol/L for KYN and 0.2 μmol/L for KYNA. The KYNA/KYN ratio of 30 urine samples of healthy subjects was 2.45±1.54. There was positive correlation between KYNA and KYN levels in urine ( r2 = 0.375 8, P<0.001).

Conclusions

The method is sensitive, accurate and stable. Using KYNA/KYN ratio to determine the activity of KAT has the characteristics of convenience and practicability and this method could be used for the clinical diagnosis and fundamental research for some relative diseases.

Keyword: Kynurenine; Kynurenic acid; Kynurenic aminotransferase; High performance liquid chromatography

犬尿氨酸(kynurenine, KYN)和犬尿喹啉酸(kynurenic acid, KYNA)是色氨酸的代谢产物。KYN和KYNA参与机体多种生理过程, 除与神经、精神、肾脏等疾病的发生、发展有密切关系外, 近年研究还发现KYN代谢通路也可能参与血压调节过程。其代谢途径中的犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)催化反应的生成物KYNA可能与血压的中枢调节有关。

随着医学界对色氨酸代谢产物及相关酶活性与人体健康研究工作的深入, 定量检测生物样本中KYN和KYNA已成为相关疾病的诊断治疗和基础研究中的重要手段。高效液相色谱(HPLC)具有抗干扰强、敏感性高、准确性好等优点, 因此被广泛用于血样测定, 此外还用于脑组织、脑脊液等。通常采用紫外检测器(UV)测定KYN[1~3], 荧光检测器(FLD)测定KYNA[1, 4, 5], 亦有采用电化学检测器测定KYN的报道[6]。尿中KYNA含量测定的文献较少[7, 8], 同时测定尿中KYN和KYNA尚未见报道。在先前的工作中, 我们测定尿中KYNA的含量来评价KAT活性及与血压的关系[7], 由于体液中KYNA和KYN的浓度受摄入的色氨酸影响[1], 因此这种方法具有一定的局限性。我们介绍的HPLC-UV、FLD同时测定尿中KYN和KYNA方法基于国内外相关研究工作的成熟经验[4, 7, 8], 方法敏感、准确。用KYNA/KYN比值评测KAT活性, 可避免或减小色氨酸摄入量造成的影响。

材料和方法
一、仪器与试剂

1. 仪器 安捷伦1100液相色谱系统(德国Agilent公司):由G1322A在线脱气机、G1311A 四元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1314A可变波长紫外可见检测器(VWD)和G1321A FLD组成。VWD和FLD由1根长15 cm、内径为0.18 mm PEEK管相连。分析柱为安捷伦HC C18反相色谱柱(250 mm × 4.6 mm内径), 填充物孔径为130 Å , 粒径5 μ m 。

2. 试剂 KYN和KYNA标准品均为Sigma公司产品, 标准品贮备液浓度为1 mmol/L, KYN由石英双蒸水配制, KYNA由2 mmol/L NaOH配制, 混合标准系列工作液由石英双蒸水临用前稀释配制并按样本处理步骤进行处理。乙腈为Tedia公司产品(HPLC/SPECTRO, 美国), 其余为国产分析纯试剂。实验用水为石英双蒸水。

二、方法

1. 色谱条件 流动相为10 mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液与7 %乙腈按体积比93∶ 7混合, pH值为4.5, 用前0.45 μ m滤膜过滤, 超声波脱气15 min, 流速1.0 mL/min。进样量50 μ L, 柱温为室温。VWD波长设定为365 nm; FLD激发波长344 nm, 发射波长398 nm。分析时间30 min。采用保留时间和标准叠加对KYN和KYNA进行定性, 用外标法测定峰面积进行定量。数据处理由HP Chemstation色谱工作站完成。

2. 方法学评价 标准溶液的浓度为0、1、3、5、7、10和 20 μ mol/L, 范围与尿样中KYN和KYNA实际存在的浓度一致, 同时制备含有尿样基体的相同系列标准溶液, 按样本处理步骤处理后进行分析。以标准曲线的浓度或加入浓度为横坐标, 各检测器信号峰面积为纵坐标作图, 将含有尿样基体的各标准溶液KYN和KYNA实际浓度减去尿样中KYN和KYNA浓度, 除以水溶液标准相应浓度, 以计算KYN和KYNA在各浓度点上的回收率。将处理后的同一份样本在不同的时间点分6次重复测试, 以观察样本在分析过程中的稳定性, 以第1次进样测定作为0 h, 其他各次测定时间根据第1次进样相对而定。精密度试验采用连续测定平行处理的12份混合尿样中的KYN和KYNA含量, 用变异系数(CV)表示。最低检测限采用3倍噪声所对应的KYN和KYNA的检测浓度。

3. 样本来源及处理 尿样由本所15名健康成年职工和研究生提供, 于午餐前和午餐2 h后分别收集, 置于-20 ℃储藏。样本中的KYN和KYNA在此保存条件下稳定至少30 d。受检尿样临用前溶解, 参照文献[7]方法处理, 将尿样和0.6 mol/L高氯酸溶液以1∶ 9比例混合, 12 000 r/min(离心半径为5.5 cm)离心5 min, 取上清液于样本瓶中待测。

三、统计学方法

数据以 x̅± s表示, 用t检验比较2组数据的差异, GraphPad Prism软件比较工作曲线斜率的差异, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、标准溶液和人尿样本色谱图

按样本处理步骤制备5 μ mol/L(原浓度)混合标准工作液和尿样, 取50 μ L进样测定, KYN和KYNA保留时间分别为6.9和11.5 min。见图1。

图1 标准溶液和人尿样本色谱图

二、方法的准确度与精密度

1.回收率 KYN和 KYNA平均回收率分别为98.74%± 7.53% 和95.17%± 8.17%。水溶液标准、标准加入工作曲线的相关系数(r2)为KYN:0.999 3、0.999 1; KYNA:0.999 0、0.999 4。曲线斜率无差异(KYN:P= 0.406 8; KYNA:P=0.646 2)。见图2。

图2 水溶液和标准加入工作曲线

2. 样本的稳定性、方法的精密度和最低检测限 同一样本中KYN 和KYNA 28 h内6 次测定的CV分别为3.35 %和0.88 %, 结果见表1。平行处理的12份混合尿样中的KYN均值为4.65 μ mol/L, CV为 2.73 %; KYNA的均值为9.73 μ mol/L, CV为2.79 %。KYN和KYNA最低检测限分别为0.4和0.2 μ mol/L(50 μ L进样量, 3倍噪声)。

表1 样本在测定过程中的稳定性
三、样本测定

午餐前与午餐2 h后尿中KYN和KYNA含量差异无统计学意义(KYN:t=0.223 5, P=0.824 8; KYNA:t=0.529 9, P=0.600 4), 尿中KYNA与KYN含量呈正相关关系(r2=0.375 8, P< 0.001), 见图3。KYN、KYNA含量和KYNA/KYN比值分别为(4.83± 3.84)μ mol/L、(9.43± 5.72)μ mol/L和2.45± 1.54。

图3 尿中KYNA与KYN的相关关系

讨 论

近年来, 随着医学界对色氨酸代谢产物及相关酶活性与人体健康研究工作的深入, 定量检测生理体液中KYN和KYNA已成为相关疾病的诊断、治疗和基础研究中的重要手段。HPLC具有抗干扰强、敏感性高、准确性好等优点, 因此被广泛采用, 其单独或联测技术用于血液、脑组织、脑脊液中的KYNA和KYN测定已有不少介绍。尿液是最容易采集到的生理体液, 人体中很多代谢物都通过尿液排出体外, 这些代谢物含量的变化与体内相关酶的活性及某些疾病密切相关。本研究介绍的HPLC UV、FLD双检测器同时测定尿中KYN和KYNA基于我们先前的HPLC FLD测定尿中KYNA方法和国内外其他相关研究工作经验, 其准确性, 精密度等指标已在相关文献中作了介绍。在用VWD测定KYN方面, 尽管在吸收波长230 nm较365 nm时的响应值更高, 但与邻近峰的分离却不理想[4], 因此我们选用365 nm作为分析波长, 以保证分析结果的准确性。由图1可见, 混合标准工作液和尿样中的KYN和KYNA在VWD和FLD的分离情况良好。需要说明的是, 尿样色谱图在27 min后有2个未知峰, 为避免这2个峰对下一次进样的影响, 样本分析时间设定为30 min。

KYN和KYNA标准曲线的浓度按尿样中实际存在的浓度范围进行配制, 所有工作曲线的r2达到0.999。KYN和KYNA水溶液和加入尿样基体的标准工作曲线的斜率差异无统计学意义, 说明尿样基体对被测物质无干扰, 标准回收良好。方法的精密度和稳定性试验表明样本处理过程不会影响测定精度, 经过高氯酸处理后的样本被测物稳定性良好。线性范围和最低检测限完全满足了样本测定需要。

使用的色谱柱为安捷伦HC C18反相柱, 其特点是要求使用的流动相中有机相含量较常规反相柱高, 如采用其他类型反相色谱柱, 则应对流动相中有机相含量作适当调整。

本研究采集尿样未作任何条件限制, 完全按照个人自然生活习惯, 因此个人饮食饮水的不同可能会对尿中KYNA与KYN含量造成一定影响。30份健康成年人尿样中KYNA与KYN含量呈正相关关系, 提示KYNA/KYN比值较KYNA含量评测KAT活性更具科学性。HPLC同时测定人尿中KYN和KYNA技术为研究KAT活性与相关疾病的关系提供了可靠的实验手段。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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