引用本文
詹勤, 张欣欣, 张东华, 于德敏, 金根娣. 乙型肝炎病毒前C区1896、基本C区启动子区1762/1764变异对拉米夫定抗病毒疗效的影响及其临床意义. 2009, 24(9): 655-658
ZHAN Qin, ZHANG Xinxin, ZHANG Donghua, YU Demin, JIN Gendi.. The effects of mutations in pre-core1896 and basic core promoter1762/1764 of Hepatitis B virus on lamivudine therapy and their significance . Labratory Medicine, 2009, 24(9): 655-658  
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乙型肝炎病毒前C区1896、基本C区启动子区1762/1764变异对拉米夫定抗病毒疗效的影响及其临床意义
詹勤, 张欣欣, 张东华, 于德敏, 金根娣
上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科,上海 200025

作者简介:詹 勤,女,1981年生,硕士,实习研究员,主要从事乙型肝炎病毒基因变异的研究。

基金:国家重点基础研究发展计划(973)资助项目(2005CB523104); 上海市科委中法政府双边合作项目(08410709100); 上海市卫生局优秀学科带头人基金资助项目(08GWD08)
摘要
目的

研究乙型肝炎病毒(HBV)前C区G1896A变异和基本C区启动子(BCP)区A1762T/G1764A双变异对拉米夫定(LAM)抗病毒疗效的影响及其临床意义。

方法

收集上海及其周边地区34例慢性乙型肝炎患者,单用LAM或LAM+聚乙二醇干扰素α-2a进行抗病毒治疗共48周,应用Trugene HBV genotyping 试剂盒测定分析治疗前(0周)、治疗过程中(24周)、治疗结束时(48周)及随访结束时(72周)RT区YMDD变异;采用HBV基因多态性检测芯片试剂盒测定前C区1896、BCP区1762/1764位点的变异情况。

结果

在治疗前有9例患者检测出前C区G1896A变异,均为HBV e抗原(HBeAg)阴性慢性乙型肝炎患者;9例前C区G1896A变异患者中7例治疗应答(77.8%,7/9),BCP区A1762T/G1764A变异在治疗应答者与无应答者中差异无统计学意义;3例患者分别在治疗24和48周时检测到YMDD变异,对治疗均无应答。

结论

慢性乙型肝炎患者治疗前血清HBV DNA变异状态可能影响LAM抗病毒治疗应答及YMDD耐药变异株的复制能力。

关键词: 乙型肝炎病毒; 前C区; 基本C区启动子区; 变异; 拉米夫定
中图分类号:R373.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0655-04
The effects of mutations in pre-core1896 and basic core promoter1762/1764 of Hepatitis B virus on lamivudine therapy and their significance
ZHAN Qin, ZHANG Xinxin, ZHANG Donghua, YU Demin, JIN Gendi.
Department of Infectious Disease, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To study the effects of Hepatitis B virus (HBV) pre-core G1896A and basic core promoter (BCP) A1762T/G1764A mutations on lamivudine(LAM) antiviral therapy and their significance.

Methods

Serum samples of 34 chronic hepatitis B patients received LAM or polyethylene glycol interferon α-2a therapy for 48 weeks were collected from Shanghai and its peripheral regions. HBV YMDD mutations on RT domain were determined by Trugene HBV genotyping kit,and the pre-core 1896 and BCP 1762/1764 mutations were determined by hepatitis B chip before treatment (0 week),during treatment (24 weeks),in the end of treatment (48 weeks)and follow up(72 weeks).

Results

The pre-core G1896A mutations were detected at week 0 in 9 patients with HBV e antigen(HBeAg)negative,of whom 77.8% (7/9) had sustained virological response. There were no significant differences between patients with sustained virological response and non-response in terms of the mutations in BCP A1762T/G1764A;YMDD mutant was detected in 3 patients after 24 and 48 weeks treatment.The 3 patients were non-reponse on treatments.

Conclusions

The status of HBV DNA mutation before antiviral therapy may affect the outcome of LAM therapy and the replication efficacy of LAM-resistant strains.

Keyword: Hepatitis B virus; Pre-core; Basic core promoter; Mutation; Lamivudine

拉米夫定(LAM)是第1个被批准用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物, 因其抗病毒作用确切, 近些年在临床上得到广泛应用。但部分患者长期服用LAM可发生耐药, 主要由乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶YMDD基序及RT区发生变异所引起, 当YMDD变异株成为优势株时就会影响其抗病毒疗效, 但一般而言, YMDD变异株复制能力低于野生株。体外研究表明, HBV基因组其他部位的基因变异, 如前C区G1896A变异、基本C区启动子(BCP)区A1762T/G1764A双变异等也可能对LAM的抗病毒疗效产生影响, 前C区及BCP区的变异可以代偿YMDD变异株的复制能力低下[1, 2]。本研究从临床角度初步探讨HBV前C区、BCP区变异对LAM 抗病毒疗效以及对YMDD变异株产生和病毒载量的影响。

材料和方法
一、患者与血清标本

上海及其周边地区34例慢性乙型肝炎患者来自瑞金医院感染科门诊及病房, 其中男26例, 女8例, 年龄19~59岁, 其诊断标准均符合2000年中华传染病与寄生虫病分会、肝病学分会修订的“ 病毒性肝炎防治方案” [3], 全部病例均被肝活检证实, 平均病程8.26年; HBV e抗原(HBeAg)阳性15例, HBeAg阴性19例。

二、治疗方案及疗效评价标准

将这34例患者随机分为2组:(1)单用LAM组(15例):LAM 100 mg/d, 口服; (2)联合LAM+聚乙二醇干扰素α -2a组(19例):LAM 100 mg/d口服+聚乙二醇干扰素α -2a 180 μ g/周皮下注射治疗, 疗程共48周。所有过程符合伦理委员会要求, 并签署患者知情同意书。抗病毒治疗48周后, 丙氨酸氨基转移酶(ALT)正常、HBV DNA< 200拷贝/mL视为应答, 其余均定义为无应答。

三、分析指标

每例患者在治疗前(0周)、治疗过程中(24周)、治疗结束(48周)及随访结束(72周)时进行血清ALT、HBV DNA定量及HBV RT区、前C区1896位、BCP区1762/1764变异的检测。

四、检测方法

1. HBV RT区变异的测定 采用美国拜尔医学诊断中心试剂盒(Trugene HBV genotyping kit), 该技术利用HBV S基因区完全重叠于P基因区内, 对HBV S基因区101~237位氨基酸和P基因RT区99~280位氨基酸序列同时进行检测, 与存储在基因库内的参考序列自动对比, 用相应S的序列来确定HBV基因型, 同时能对S基因区及P基因RT区的变异(包括已发表、未发表位点的编码变化)进行分析。主要过程包括扩增HBV基因片段, 扩增产物随后被加到1套四管专属单管化学反应技术(CLIP)测序反应管中反应, 再将反应产物加在高电压作用下电泳70 min, 自动在Long-Read Tower DNA测序仪上进行自动DNA序列分析, 运用GeneObjects软件包根据实时序列数据, 结合每一对正向及反向序列, 与存储在HBV GeneLibrarian software module 的参考序列进行自动比对。

2. 前C区1896位及BCP区1762/1764变异的测定 采用宁波瑞芯生物科技有限公司生产的HBV基因多态性检测芯片试剂盒, 该芯片探针主要针对临床常见的前C区G1896A位及BCP区A1762T/G1764A 2种变异。严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。主要实验步骤包括:聚合酶链反应(PCR)扩增、杂交检测、扫描分析判定。

3. 其他病毒指标检测 HBV DNA定量检测采用罗氏Cobas Taqman, 最低检测水平为200 拷贝/mL, HBV血清标志物采用美国雅培Axyme检测试剂。

五、统计学方法

采用SAS软件包, 率的比较用χ 2检验, 均数比较用t检验。

结 果
一、HBV前C区1896位及BCP区1762/1764变异的检测

34例慢性乙型肝炎患者治疗前有9例出现前C区1896位G→ A变异, 占26.5%(9/34); 有14例患者在BCP区1762/1764位检出AGG→ TGA双变异, 占41.1%(14/34), 另有4例患者为AGG/TGA野生株、变异株混合感染, 以上变异在治疗过程中持续存在。9例G1896A变异全部为HBeAg阴性患者, G1896A变异在HBeAg阴性患者中的检出率显著高于HBeAg阳性患者(P< 0.01)。而BCP区A1762T/G1764A变异检出率在HBeAg阴性和HBeAg阳性患者差异无统计学意义(42.1%, 8/19和40.0%, 6/15)。3例患者同时检测到G1896A及A1762T/G1764A变异, 均为HBeAg阴性患者, 占15.8%(3/19), HBeAg阳性患者中未发现2种变异同时发生者。

二、 RT区YMDD位点变异检测情况

所有患者在治疗前没有检测到YMDD变异, 治疗过程中有3例患者分别在24和48周发生了YMDD变异, 均为rtM204I变异, 其中2例患者还同时伴有rtL180M变异, 治疗效果均为无应答。这3例患者在治疗结束后24周(即72周)时YMDD变异株均为阴性。YMDD及其前C区、BCP区变异株动态变化与HBV DNA、ALT之间的关系见图1。

图1 YMDD变异株动态变化与HBV DNA、ALT之间的关系

三、HBV前C区1896位、BCP区1762/1764变异及YMDD变异情况与抗病毒疗效相关性

按照治疗结束时(48周)ALT正常、HBV DNA< 200拷贝/mL将所有患者分为治疗应答组(22例)与无应答组(12例)。发生前C区G1896A变异的9例患者中, 有7例治疗应答(77.8%, 7/9), 仅2例无应答(22.2%, 2/9)。BCP区A1762T/G1764A双变异患者中, 应答者及无应答者分别有6例和8例, BCP区双变异在应答者和无应答者中差异无统计学意义。3例发生YMDD变异患者治疗均无应答, 其中1例合并BCP1762/1764双变异, 1例同时合并前C区及BCP区变异。

讨 论

前C区G1896A是HBV的常见变异, 该变异被认为与HBeAg阴性的HBV感染相关, 主要机制为前C区第28密码子TGG转变为终止码TAG, 导致前C蛋白翻译终止, HBeAg不能产生; HBV另一常见变异位于BCP区, 通常为A1762T/G1764A的联合突变, 一些研究表明该变异与活动性肝炎、肝硬化、肝癌、急性肝功能衰竭等相关[4~6]。由于该变异会影响前C区mRNA的合成效率, 使HBeAg的产生下降, 故也是引起HBeAg阴性HBV感染的机制之一。本研究19例HBeAg阴性的HBV感染患者中分别有47.4%(9/19)及42.1%(8/19)检测到以上2种变异类型, 但另有4例患者既没有前C区G1896A变异, 也无BCP区双变异的发生。在HBeAg的合成分泌过程中有许多步骤参与, 包括前C mRNA的转录、HBeAg前体的翻译及翻译后加工等, 其中由于前C区内部发生点替换突变、C区内部缺失突变或插入突变等影响到其中任一个环节, 都可能对HBeAg的表达产生影响, 导致HBeAg产生下降或不能产生, 如nt1862位C→ T、nt1814位A→ C变异已有报道[7]。由此可见, 导致HBeAg阴性慢性乙型肝炎的原因不只局限于前C区G1896A变异或BCP区A1762T/G1764A, 这值得进一步研究探讨, 以利于对HBeAg阴性慢性乙型肝炎的深入认识。

HBV前C区G1896A及BCP区A1762T/G1764A变异会对LAM抗病毒治疗疗效产生何种影响, 是目前研究的热点之一。国内外一些研究表明, 前C区G1896A和BCP区A1762T/G1764A变异不会对药物的敏感性产生影响, 变异对LAM治疗后出现的病毒学反弹没有影响[8, 9]。但另有学者在临床试验中发现, LAM治疗过程中存在前C区1896位变异株向野生株转换的现象, 且野生株在之后的治疗过程中持续稳定存在[10, 11]。这种现象提示, LAM对HBV前C区变异株更敏感, 对其复制抑制作用强于野生株, LAM可能是该类患者有效的治疗药物之一。BCP区A1762T/G1764A双变异可能与治疗中病毒学反弹相关也见报道[12]。本研究中, 有9例患者治疗前就检测到前C区1896位变异, 仅2例无应答, LAM可能对HBV前C区变异的患者有效。BCP区双变异则对抗病毒治疗应答率无影响。

LAM长期治疗过程中, YMDD变异是引起耐药的主要机制, 许多因素被认为与YMDD变异相关, 如LAM用药时间、用药前病毒载量、ALT水平、HBV基因型等。然而一般而言, LAM治疗过程中即使出现YMDD变异, 由于变异株HBV复制能力存在缺陷, 复制能力低于野生株, 血清HBV DNA载量低于治疗前水平[13]。目前的研究认为, 前C区变异也与YMDD变异相关。国内有报道, G1896A突变株患者使用LAM治疗, YMDD变异发生率低[9]; 而Tassopoulos等[14]认为, 前C区变异株感染的患者发生YMDD变异率较高。体外研究发现, 前C区G1896A和BCP区A1762T/G1764A变异虽然不会对药物的敏感性产生影响, 但这些变异可以代偿LAM耐药变异株复制效率低下, 甚至增加耐药突变株的复制, 超过野生株的基线复制水平[1, 2], 这很好地解释了为什么一些患者在出现YMDD变异后病毒复制增加, 病情恶化。本研究中我们仔细观察出现YMDD变异的3例患者, 其中1例合并BCP区双变异, 1例同时合并前C区、BCP区2种变异, 该2例患者均在48周时出现血清病毒反弹, 且HBV DNA高于治疗前基线水平。这从临床的角度支持了上述观点, 治疗过程中病毒学反弹并病情恶化可以是多个位点联合变异共同作用导致的结果。这提示我们, 同一患者体内HBV同时出现不同部位的联合变异值得警惕, 尤其对治疗前即存在前C区1896位及BCP区1762/1764双变异的患者, 在选择适当的治疗药物和方案之前, 应综合权衡各位点变异情况, 并在抗病毒治疗过程中加强监测, 以便及时处理。

The authors have declared that no competing interests exist.

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