引用本文
王永忠, 吴国祥, 濮翔科, 陈敏, 肖君华, 杨志军. 连接酶反应检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药突变的初步研究. 2009, 24(9): 651-654
WANG Yongzhong, WU Guoxiang, PU Xiangke, CHEN Min, XIAO Junhua, YANG Zhijun. Detection of adefovir-resistant mutations in Hepatitis B virus by the ligase detection reaction . Labratory Medicine, 2009, 24(9): 651-654  
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连接酶反应检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药突变的初步研究
王永忠1, 吴国祥1, 濮翔科1, 陈敏1, 肖君华2, 杨志军3
1. 江苏常州市第三人民医院检验科,江苏 常州 213001
2. 东华大学生物科学与技术研究所,上海 201620
3. 上海复星医学科技发展有限公司,上海 200233

作者简介:王永忠,男,1969年生,副主任技师,主要从事临床检验和分子诊断研究。

摘要
目的

建立一种基于连接酶检测反应(LDR)技术的方法,检测慢性乙型肝炎患者阿德福韦(ADV)耐药突变rtA181V/T和rtN236T。

方法

设计特异性引物和针对不同突变类型的探针,聚合酶链反应(PCR)扩增后进行LDR,最后在测序仪上分析结果。以直接测序法作为对照分析55例临床标本,对结果不一致的标本进行亚克隆测序确认。

结果

LDR能够在野生型质粒背景下检测到1%的rtA181V/T或rtN236T突变质粒,不与野生型质粒及血清常见病毒产生交叉扩增。55例临床标本中检测到8例(14.5%)rtA181V/T和rtN236T双突变,6例(10.9%)rtA181V/T单突变,7例(12.7%)rtN236T单突变,与直接测序法结果一致的标本有52例(94.5%)。对3例结果不一致的标本进行亚克隆测序分析,结果与LDR一致。

结论

LDR是一种特异、敏感的方法,可以用于监测慢性乙型肝炎患者ADV耐药突变。

关键词: 连接酶检测反应; 乙型肝炎病毒; 阿德福韦; 耐药
中图分类号:R373.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0651-04
Detection of adefovir-resistant mutations in Hepatitis B virus by the ligase detection reaction
WANG Yongzhong1, WU Guoxiang1, PU Xiangke1, CHEN Min1, XIAO Junhua2, YANG Zhijun3
1. Department of Clinical Laboratory, Changzhou the Third People's Hospital, Jiangsu Changzhou 213001,China
2.School of Chemistry and Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China
3. Shanghai Fosun Med-Tech Development Company Limited, Shanghai 200233, China
Abstract
Objective

To develop a method based on the ligase detection reaction (LDR) for detection of rtA181V/T and rtN236T mutations associated with adefovir(ADV) resistance of Hepatitis B virus (HBV) in chronic hepatitis B patients.

Methods

Specific primers and probes were designed to detect different mutations. The LDR test was performed after polymerase chain reaction (PCR) amplification and the results were analyzed on a sequencer. Both LDR and sequencing were used for the detection of 55 clinical samples. Discrepant results between the two methods were confirmed by sub-clone sequencing.

Results

The LDR test detected 1% of mutant plasmids in the background of wild type plasmids, and no crossing amplifications were observed for wild type plasmids and common non-HBV virus in human serum. The LDR detected eight (14.5%) dual mutations of rtA181V/T and rtN236T, six (10.9%) rtA181V/T mutations, and seven (12.7%) rtN236T mutations. Complete concordance between LDR and sequencing was observed with 52 of 55 (94.5%) samples. Three discrepant samples were analyzed by sub-clone sequencing, and the results were concordant with LDR.

Conclusions

LDR test is a specific and sensitive method for monitoring ADV-resistant mutations of HBV in patients with chronic hepatitis B.

Keyword: Ligase detection reaction; Hepatitis B virus; Adefovir; Drug-resistance

乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范围内非常普遍, 我国是乙型肝炎的高发区, HBV的反复感染, 可能导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌, 积极的抗病毒治疗可以有效提高患者的生存质量。阿德福韦(ADV)是目前治疗慢性乙型肝炎的一线药物之一, 能够有效抑制HBV在肝细胞内的复制。然而, 随着使用时间的延长, ADV耐药率将逐步提高, 临床上急需敏感性高、特异性好的方法检测HBV ADV耐药突变。本研究建立了一种基于连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)技术的ADV耐药突变检测方法, 以期特异性地检测HBV群体中低比例的耐药突变株, 为早期发现ADV耐药提供依据。

材料和方法
一、临床标本

55例标本取自2006年8月至2008年11月在常州市第三人民医院肝病科接受ADV治疗半年以上, 血清HBV DNA仍然> 103拷贝/mL的慢性乙型肝炎患者, 其中男39例, 女16例, 年龄28~57岁。血清收集后保存于-70 ℃待用。

二、主要仪器与试剂

聚合酶链反应(PCR)扩增仪PE9600、荧光PCR扩增仪ABI Prism 7500及测序仪ABI Prism 377均为美国应用生物系统公司产品。血清HBV DNA提取及定量试剂购自上海复星医学科技发展有限公司。质粒提取试剂、Taq酶及DNA连接酶为Qiagen公司产品。包含HBV ADV耐药突变的质粒由东华大学生物科学与技术研究所惠赠。

三、引物和探针

引物及探针序列见表1, 由上海生工生物工程技术有限公司合成。

表1 引物及探针序列
四、模板DNA提取

血清HBV DNA及质粒DNA均采用相应试剂盒, 严格按照说明书进行操作。

五、PCR扩增

PCR扩增体系包括10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl (pH值8.3)、50 mmol/L KCl、2.0 mmol/L MgCl2、200 μ mol/L dNTP、300 nmol/L引物、1.5 U 热启动Taq酶、5 μ L DNA模板, 总反应体积为50 μ L。反应条件为:首先在95 ℃反应10 min以激活热启动酶, 然后95 ℃ 30 s, 54 ℃ 50 s, 72 ℃ 60 s, 扩增35个循环, 最后72 ℃ 延伸10 min。

六、LDR检测

LDR反应体系包括20 mmol/L Tris-HCl(pH值7.6)、10 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl、10 mmol/L二硫苏糖醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、12.5 nmol/L探针或引物、3 μ L PCR产物、0.1 mmol/L DNA连接酶, 总反应体积为20 μ L。反应条件为:95 ℃ 2 min, 然后95 ℃ 30 s, 65 ℃ 4 min, 循环30次。扩增完成后加入0.5 μ L浓度为0.5 mmol/L的EDTA使反应终止。取2.5 μ L反应产物与等体积上样缓冲液混合, 然后在94 ℃变性2 min, 迅速在冰上冷却, 立即加入ABI Prism 377测序仪变性凝胶进行电泳30 min。电泳结果采用Genemapper软件进行分析。

七、DNA测序

LDR剩余的PCR产物经纯化后送上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定。

八、PCR产物亚克隆及测序

PCR产物直接克隆到载体pGEM-T, 以大肠埃希菌JM109为宿主菌, 在含氨苄西林、异丙基-β -d-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖苷(X-Gal)的LB平板上培养。挑选白色单菌落在含有100 mL LB培养基的三角瓶中培养, 采用质粒抽提试剂盒抽提质粒, 经PCR扩增确认含有目的片段后送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。

结 果
一、对照质粒检测结果

首先对含有HBV rtA181及rtN236位点突变型及野生型的质粒分别进行检测, 每个反应重复3次, 均得到预期的检测结果, 与野生型质粒没有交叉扩增。

将含有rtA181T、rtA181V及rtN236T的质粒分别稀释成106、105、104、103及102 拷贝/mL进行检测, 每个检测反应重复3次。其中103 拷贝/mL以上的质粒均能稳定地检出突变, 但102 拷贝/mL的质粒则至少有1次未能有检测结果, 因此可以认为本方法检测的敏感性为103 拷贝/mL。

以甲型肝炎病毒(HAV) RNA、丙型肝炎病毒(HCV) RNA及人巨细胞病毒(HCMV) DNA为模板进行检测, 未检测到阳性信号。

二、混合质粒实验

分别将含有rtA181T、rtA181V及rtN236T的质粒与野生型质粒按照1∶ 1、1∶ 10、1∶ 100及1∶ 1 000的比例进行混合, 总浓度为105 拷贝/mL, 然后进行检测, 结果见图1。可见本方法能够在野生型质粒背景中检测出1%的突变质粒。

图1 LDR检测rtA181V变异质粒与野生型质粒混合结果

三、临床标本LDR检测结果及测序结果

55例临床标本中LDR共检出21例(38.2%)突变标本, 其中8例(14.5%)rtA181V/T和rtN236T双突变, 6例(10.9%)rtA181V/T单突变, 7例(12.7%)rtN236T单突变。测序法共检出8例(14.5%)rtA181V/T和rtN236T双突变, 5例(9.1%)rtA181V/T单突变和5例(9.1%)rtN236T单突变。2种方法检测不一致的3例(5.5%)标本LDR检测结果均为低比例的混合突变。2种方法的符合率为94.5%。

8例双位点突变的标本均来自治疗时间超过2年的患者, 而且出现临床耐药。13例单位点突变患者中有8例出现临床耐药。所有检出突变的患者均接受ADV治疗超过1年半时间。

四、亚克隆测序

对3例LDR与测序不一致的标本进行亚克隆测序确认。每例标本挑选20个亚克隆进行测序分析, 分别发现有2个、3个及5个亚克隆含有突变序列, 与LDR的检测结果一致。

讨 论

慢性乙型肝炎患者需要接受长期的抗病毒治疗, 但随着治疗时间的延长, 往往会产生耐药突变而导致治疗失败。因此, 临床上需要灵敏的方法检测耐药突变, 以便及早调整治疗方案。ADV是目前治疗慢性乙型肝炎的一线药物之一, 但随着治疗时间的延长其耐药突变率也逐渐提高。ADV治疗2、3和5年的耐药率分别为2.0%、5.9%和29.0%[1~3]。HBV聚合酶基因rtA181V/T及rtN236T位点突变是导致ADV耐药最主要的突变类型[4]。尽管体外实验表明这2种突变只能使HBV对ADV的敏感性降低5%~10%[5], 但临床结果却表明发生这2个位点突变的患者出现明显的病毒反弹和肝功能失代偿[6]。发生rtN236T突变的病毒仍然对拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦敏感; 发生rtA181V/T突变的病毒对拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦的敏感性降低8~16倍, 但对泰诺福韦仍然敏感[1]。因此, 监测ADV耐药突变及其类型不仅可以早期发现耐药现象, 而且可以为调整治疗方案提供依据。

尽管有多种方法可以用来监测ADV耐药突变, 但临床上应用最多的还是测序法和线性探针反向杂交技术(LiPA)[7]。测序法敏感性较低, 只能检测到病毒群体中20%以上的突变株, 不能进行高通量检测[7], 且其结果判断需要对测序图谱进行认真细致的分析。LiPA由于价格昂贵, 不适合在HBV高度流行的发展中国家大面积推广。LDR技术已经广泛应用于单核苷酸多态性分析[8], 并且成功应用于低比例HBV拉米夫定耐药突变株的检测, 可以检测到HBV群体中1%的YIDD变异株[9]。

本研究采用LDR技术建立HBV ADV耐药突变检测方法, 能够在混合质粒中检测到1%的突变质粒, 具有很高的敏感性。与非突变类型的质粒和血清中常见的非HBV病毒没有交叉扩增, 具有很好的特异性。采用本方法检测临床标本, 与测序法的符合率达到94.5%。通过对3例与测序法结果不符的标本进行亚克隆测序分析, 确认LDR检测的结果与亚克隆测序结果一致, 表明本方法的敏感性高于测序法, 可以在病毒群体中发现更低比例的耐药突变株。

本研究检测的标本均来自接受ADV治疗半年以上且血清HBV DNA浓度> 103拷贝/mL的患者。55例患者中共有21例(38.2%)检出ADV耐药突变, 且有16例出现临床耐药, 表明长期接受ADV治疗仍然没有产生病毒学完全应答的患者发生耐药突变的比例比较高。Fung等[10]2006年报道, 接受ADV治疗2年的累积耐药突变率可达22%。综合这些结果可以推断, 随着ADV应用时间的延长和应用范围的扩大, 耐药突变率将逐渐提高。本方法应用于ADV治疗的耐药监测, 有助于早期发现耐药现象, 合理确定治疗方案。

总之, 本研究建立的方法特异性好, 敏感性较高, 可以检测到病毒群体中低比例突变株, 有望用于ADV耐药的临床监测。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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