引用本文
章莉, 张玥, 方风琴, 华丽, 邱定忠, 季育华. 人巨细胞病毒临床分离株对更昔洛韦耐药的表型分析. 2009, 24(9): 646-650
ZHANG Li, ZHANG Yue, FANG Fengqin, HUA Li, QIU Dingzhong, JI Yuhua. Analysis of the ganciclovir-resistant phenotype of Human cytomegalovirus clinical isolates . Labratory Medicine, 2009, 24(9): 646-650  
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《检验医学》编辑部
人巨细胞病毒临床分离株对更昔洛韦耐药的表型分析
章莉1, 张玥1, 方风琴1, 华丽1, 邱定忠2, 季育华1
1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海 200025
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院儿内科,上海 200025

作者简介:章 莉,女,1984年生,学士,主要从事人巨细胞病毒感染的监测与耐药性研究。

通讯作者:季育华,联系电话:021-64370045-600637。

基金:上海市科委重点科技攻关专项基金资助项目(074119521)
摘要
目的

检测分析人巨细胞病毒(HCMV)临床分离株的更昔洛韦(GCV)耐药表型。

方法

收集临床接受GCV治疗过的各类移植受体的血液或尿液标本以及婴幼儿HCMV感染症患儿的尿液标本,分离HCMV。然后通过噬斑减少试验测试其对GCV药物的耐受性。病毒株对GCV的耐受性程度表示以不加药物孔中病毒致细胞病变效应(CPE)为参照,能够抑制50%CPE的药物浓度(IC50)为GCV的耐受性。GCV敏感型毒株的IC50为≤5.000 μmol/L。

结果

以标本接种人胚肺成纤维细胞(MRC-5),最终获得病毒株共33株。其中6株来自移植受体,27株来自婴幼儿HCMV感染症患儿。以MRC-5为敏感细胞,调整所测病毒浓度为100×50%组织培养感染量(TCID50),并加入不同浓度的GCV药物,检测发现32株GCV的IC50均≤5.000 μmol/L(1.500~5.000 μmol/L),只有1株GCV IC50为12.500 μmol/L。同步平行检测的标准毒株HCMV AD169的GCV IC50为1.500 μmol/L。

结论

药物耐受表型测定能够了解并评估病毒对GCV药物的敏感与否,但全过程周期较长,技术要求比较高,尤其必须以获得活病毒为前提,尚难以直接推向临床实验室。

关键词: 人巨细胞病毒; 更昔洛韦; 表型; 药物敏感性
中图分类号:R373.9 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0646-05
Analysis of the ganciclovir-resistant phenotype of Human cytomegalovirus clinical isolates
ZHANG Li1, ZHANG Yue1, FANG Fengqin1, HUA Li1, QIU Dingzhong2, JI Yuhua1
1. Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
2. Department of Children's Internal Medicine,Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To study the ganciclovir (GCV)-resistant phenotyping of Human cytomegalovirus (HCMV) clinical isolates.

Methods

HCMV was isolated from the urine of congenital HCMV infection patients and the anticoagulated blood or the urine of transplant recipients who had been treated with GCV. Drug susceptibility was determined by the plaque reduction assay. The degree of GCV susceptibility based on the viral cytopathic effects (CPE) of drug free plaques, and the concentration of drug reduced the number of plaques by 50% was namely IC50 of GCV.IC50 value of sensitive HCMV isolates was less than or equal to 5.000 μmol/L.

Results

Thirty three HCMV isolates were isolated from different materials on MRC-5 cells. Six HCMV isolates were from six kidney transplant recipients and 27 from patients with congenital HCMV infection. For MRC-5 cells as sensitive cell, 100×50% tissue culture infective dose(TCID50) were inoculated on 96-well microtiter plates under increasing concentrations of GCV. Thirty two clinical HCMV isolates showed GCV IC50 value was less than or equal to 5.000 μmol/L (range 1.500-5.000 μmol/L), only one clinical HCMV isolates showed GCV IC50 value of 12.500 μmol/L.Parallel examination of HCMV AD169 were performed and showed GCV IC50 value of 1.500 μmol/L.

Conclusions

The phenotyping of drug susceptibility could be used for evaluating whether the virus is sensitive to GCV or not. However, it is time-consuming and requires high technology, especially the isolation of the living virus,which impedes the assay application in clinical laboratory.

Keyword: Human cytomegalovirus; Ganciclovir; Phenotype; Drug susceptibility

器官移植术后免疫耐受的特殊群体都非常关注人巨细胞病毒(HCMV)感染症的诊断与治疗[1]。随着抗病毒药物的不断问世, 病毒耐药成为不可避免的严峻问题。1988年首次报道了关于更昔洛韦(GCV)耐药病毒株的分离[2], 类似报道随之而来。我国HCMV耐药的研究起步较晚, 相关方面的报道资料少见。考虑病毒耐药的发生与发展必定与群体特征、用药的种类与剂量配伍等密切相关[3], 本研究立足中国人群临床分离的HCMV毒株GCV耐受性的检测与分析, 旨在发现并分析中国人群HCMV的耐药状况。

材料和方法
一、材料

1. 标本 HCMV标准毒株AD169由上海市传染病医院蒋伟伦教授惠赠, 实验室经人胚肺成纤维细胞扩增后长期冻存于-170 ℃液氮罐备用。待检测的HCMV临床标本取自瑞金医院移植外科接受预防或干预治疗的受者血液或尿液标本及儿内科收治的婴幼儿HCMV 感染症患儿的尿液标本。HCMV感染症以HCMV IgG初筛检测为阳性, 并经HCMV pp65抗原血症检测和HCMV DNA血症检测的结果中任何一项阳性为判断依据。

2. 细胞和主要试剂 人胚肺成纤维细胞(MRC-5)购自美国菌种保藏中心(Catalog No.CCL-171), 按常规方法培养、传代或冻存。测定用细胞为复苏后传2~3代的细胞。细胞培养所用最小基础培养基(MEM)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自Invitrogen公司; 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、谷氨酰胺和二甲基亚砜(DMSO)购自华美公司; 青霉素、庆大霉素购自上海先锋药业公司; GCV为湖北潜龙药业有限公司产品, 使用时用灭菌去离子水配制成母液(4.5 mmol/L), 并经0.22 μ m滤器过滤后分装4 ℃保存备用。间接免疫荧光检测HCMV pp65抗原试剂盒为荷兰IQ公司产品。

二、方法

1. 血液、尿液标本的处理和保存 收集乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血, 分离血浆和白细胞, 暂存4 ℃待分离病毒(14 d内)或冻存-80 ℃, 测前冻融。尿液标本为晨尿或床边收集, 保存同前, 但需要加入10%的青霉素和庆大霉素。接种的标本均经0.22 μ m滤器过滤。

2. HCMV体外分离培养 病毒分离接种的前1天, 将MRC-5细胞铺种于24孔培养板(每孔1× 105 mL)。将分离的白细胞或滤过的尿液标本接种细胞板(白细胞每孔1× 105个或尿液每孔200 μ L), 同时设标准毒株HCMV AD169(10-3~10-4)为对照。于37 ℃ 1 500 r/min(离心半径为8 cm)离心吸附60 min后补充2% FBS-MEM, 置37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。隔日观察并记录, 根据培养液的pH值变化更新培养液。待细胞病变近100%时, 收获培养物(上清和细胞)。收获物经37 ℃和-80 ℃快速冻融3次, 离心取上清(病毒液), 分装-80 ℃冻存。

3. 病毒的感染性滴度测定方法 参照张卓然[4]的50%组织培养感染量(TCID50)病毒感染性测定, 并调整各待测标本的病毒浓度为100× TCID50。

4. HCMV的GCV耐药表型测定 参照张卓然[4]的体外抗病毒药效试验的指南做部分改良, 即将原配置的GCV母液(4.5 μ mol/L)用10%FBS-MEM培养液做系列稀释, 其浓度分别为0、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、15.0和50.0 μ mol/L, 共9个浓度。置37 ℃ 5%CO2培养箱中培养7 d, 逐日观察并记录。设HCMV AD169为对照, 每个药物浓度做4个复孔, 计算均值。GCV耐受性的结果以其不加药物即0孔为基准, 记录能抑制50%病毒致细胞病变效应(CPE)的药物浓度(IC50)

结 果
一、感染性标本(血或尿)HCMV体外分离培养结果

将由标本分离的白细胞或经无菌处理的尿液标本接种MRC-5细胞后, 经培养观察, 其中有33份可明显见到CPE, 呈现HCMV病灶, 临灶细胞变大, 变圆, 肿胀且呈延细胞分布长轴方向排列的特性, 与标准毒株HCMV AD169的表现非常相似, 见图1a。经HCMV pp65单克隆抗体染色, HCMV病灶出现明显的亮绿色, 见图1b。

图1 感染性标本体外分离HCMV的细胞病变

二、病毒感染性滴度测定

将收获的待检病毒上清液, 按照实验方法3的步骤分别做101~109的连续10倍稀释后分别接种于MRC-5细胞中(每孔100 μ L), 同一稀释度设置4个复孔。然后置37 ℃ 1 500 r/min(离心半径为8 cm)离心吸附60 min, 每孔补充2%FBS-MEM 100 μ L, 再连续37 ℃ 5%CO2培养箱培养7 d。逐日观察、记录, 随着待测病毒液浓度的递减, MRC-5上出现的CPE量随之减少。33株分离病毒液的TCID50分别为5.8× 103~1× 106不等, 见图2。

图2 病毒的滴度测定

三、HCMV的GCV耐药表型测定

根据药物耐受性测定需要, 分别将待测病毒株的浓度调整为100× TCID50/mL, 每孔接种50 μ L, 置室温60 min后, 每孔添加不同浓度的GCV药液。37 ℃ 5%CO2培养7 d, 观察并记录。被测的33株GCV IC50见表1。除6号病毒株的GCV为12.500 μ mol/L外, 余32株的GCV IC50均≤ 5.000 μ mol/L, 据相关资料报道判断此32株对GCV敏感。

表1 HCMV临床分离株的GCV敏感性测定结果
讨 论

为了及时、早期发现HCMV是否耐药, 必须实施病毒针对某种抗病毒药物的耐受性测定[5]。而体外病毒的耐受性测定如同细菌, 可以从其表型分析或基因型分析着手。耐药表型分析即将分离的病毒株与含有不同浓度的抗病毒药物作用并置于此环境中培养, 通过观察其对CPE的影响来评估该药物是否具有抗病毒效应。方法传统、经典, 其结果更接近现实。

我们借鉴此方法对临床分离的病毒株进行了检测, 除1株来自肾移植受体的毒株被判断为耐药外, 余32株均表现为GCV敏感。此32株中有27株来自婴幼儿HCMV感染症, 从未接受过GCV治疗或对GCV暴露天数很少。而1株被判为耐药的造血干细胞移植受者, GCV暴露已≥ 90 d, 而且该患者临床体征和实验室HCMV DNA载量也持续不降, 结合同时实施的耐药基因型分析(另报道), 其HCMV UL97基因型为M460V(一个已被国外研究资料肯定的GCV耐药相关基因突变型)。

本研究的整个过程反映出耐药表型分析是一项耗时的工作, 并且要求掌握较高的实验室技术操作能力。虽然有关病毒耐药表型分析出现了相继的改良, 如杂交方法检测HCMV DNA, 定量聚合酶链反应(PCR)或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒在抗病毒药物作用下特异性DNA或病毒抗原的变化, 流式细胞术、免疫荧光或免疫酶法等相继开发与应用[6, 7], 在缩短耗时, 纠正结果判断主观因素的影响等方面得以很大的改善, 但检测终究需要活病毒。据我们同步的耐药基因型分析初试结果表明, 无需活病毒分离, 通过直接测定与耐药相关的病毒基因, 予以提示或判断。2种不同分析方法的比较与评估尚待获得更充分的试验资料后再开展。

中国人群中HCMV耐药的相关研究起步较晚, 有资料报道不同群体感染HCMV毒株不同, 潜伏病毒的内环境千差万别, 临床治疗HCMV感染症的药物种类、剂量和配伍等都不同。我们深信, 只要能不断地深入研究, 并且不断地扩大研究数据, 就一定会获得完全能解释并且适宜中国人群的HCMV耐药监测的新思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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