引用本文
曹国君, 章莉, 华丽, 张玥, 方风琴, 季育华. 人巨细胞病毒对更昔洛韦耐受性的基因型鉴别方法的建立和应用. 2009, 24(9): 642-645
CAO Guojun, ZHANG Li, HUA Li, ZHANG Yue, FANG Fengqin, JI Yuhua.. The establishment and application of the method for identifying ganciclovir-resistant genotypes of Human cytomegalovirus . Labratory Medicine, 2009, 24(9): 642-645  
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人巨细胞病毒对更昔洛韦耐受性的基因型鉴别方法的建立和应用
曹国君, 章莉, 华丽, 张玥, 方风琴, 季育华
上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海 200025

作者简介:曹国君,男,1984年生,学士,主要从事人巨细胞病毒感染的监测与耐药性研究。

通讯作者:季育华,联系电话:021-64370045-600637。

基金:上海市科委重点科技攻关专项基金资助项目(074119521)
摘要
目的

建立实验室检测人巨细胞病毒(HCMV)更昔洛韦(GCV)耐药的基因型分析的常规方法。

方法

采用巢式聚合酶链反应(PCR)直接扩增33例HCMV感染患者的外周血白细胞及前期实验同步获得的33例临床分离毒株的HCMV UL97基因片段,对扩增产物进行测序,与HCMV标准毒株AD169序列比对,参照国外报道的耐药相关的热点突变,判定各临床分离毒株的耐药基因型。

结果

除有1株为HCMV UL97呈M460V突变型外,余32株同标准株AD169的序列一致。同一患者的分离毒株与外周血白细胞中测得HCMV UL97基因序列完全一致。

结论

建立的实验室检测HCMV耐药的基因型分析完全可以替代传统的耐药表型分析,前者无需分离活病毒,不仅需时短,而且相对安全,其技术要点更适宜临床推广应用。

关键词: 人巨细胞病毒; UL97基因; 更昔洛韦; 耐药; 基因型
中图分类号:R373.9 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)09-0642-04
The establishment and application of the method for identifying ganciclovir-resistant genotypes of Human cytomegalovirus
CAO Guojun, ZHANG Li, HUA Li, ZHANG Yue, FANG Fengqin, JI Yuhua.
Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To establish a routine method for analyzing ganciclovir(GCV)-resistant genotypes of Human cytomegalovirus (HCMV).

Methods

DNA extracted from peripheral leukocytes of 33 patients with HCMV infection and 33 clinical isolated strains were used to amplify UL97 gene by nested polymerase chain reaction(PCR), then they were sequenced. After making a contrast with AD169, the significant mutants were found according to verifying drug-resistant sites.

Results

After amplifying and sequencing, only one drug-resistant mutant (M460V) was found. The rest of them had sequences identical to AD169. UL97 gene from different samples of one patient was invariable.

Conclusions

Genotypic assay for drug-resistant detection can completely replace the phenotypic method for clinical routine use due to its advantages, such as rapidity, simplicity, precision,which are more suitable for clinical application.

Keyword: Human cytomegalovirus; UL97 gene; Ganciclovir; Drug resistance; Genotype

细菌耐药的形势严峻, 那么病毒的耐药呢?近年来国外在人巨细胞病毒(HCMV)耐药突变的研究中取得了重要发展, 发现与HCMV耐药相关基因UL97和/或UL54的突变是病毒耐药产生的主要机制[1]。有文献报道, HCMV感染后发生耐药的患者占器官移植后人群的5%~10%[2], 而我国HCMV耐药的研究起步比较晚, 这方面观察资料极少。为了了解我国HCMV耐药基因变异的基本情况, 本研究小组拟建立病毒耐药基因型分析的方法, 并将临床分离毒株和其血细胞标本中病毒基因的检测分析作平行比较。

材料和方法
一、材料

1. 标本 HCMV标准毒株AD169由上海市传染病医院蒋伟伦教授惠赠。HCMV感染性标本取自瑞金医院移植外科和儿科33例HCMV感染者的抗凝外周血标本56份和获分离的临床病毒株33株。

2. 主要试剂与仪器 2%乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)、0.84% NH4Cl、苯酚、氯仿和无水乙醇为上海化学试剂有限公司产品。DNA相对分子质量标准、dNTP混合液购自大连宝生物工程公司。高保真Taq Plus DNAⅠ 聚合酶购自上海生工公司。聚合酶链反应(PCR)引物合成和核酸序列分析委托上海英俊生物技术有限公司完成。PCR扩增仪为德国Eppendorf公司, 凝胶成像系统及分析系统为上海天能生物有限公司。

二、实验方法

1. 外周血HCMV DNA提取 取2.0 mL 2% EDTA-Na2抗凝, 经红细胞裂解后获白细胞, 再通过酚-氯仿抽提法获得待检标本DNA。由电泳和紫外分光光度计鉴定和计算所提取的DNA纯度和浓度, -20 ℃保存备用。

2. 临床分离的毒株和标准HCMV AD169的DNA提取 将HCMV AD169 标准病毒株感染人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的同时, 将临床收集的HCMV患者血或经滤过的尿液标本也接种MRC-5细胞, 10~14 d后细胞的病变近100%时收获病变的细胞和培养上清, 再将细胞经超声破碎(20 kHz, 10 s间歇), 14 000 r/min(离心半径为8 cm)离心10 min后留取上清液作为病毒颗粒悬液, HCMV DNA的提取同前。

3. 对HCMV更昔洛韦(GCV)耐药相关基因的扩增 参照文献[3], 委托上海英俊生物技术有限公司设计合成HCMV UL97基因扩增用引物3对和HCMV UL54基因扩增用引物4对, 见表1、2。由CPL97-F和CPL97-R为外引物, 分别获得产物的长度见表1、2。反应条件为1× 缓冲液 (含镁离子)、10 nmol dNTP、2.5 U Taq、25 pmol 引物和6 μ L DNA模板, 总体积为50 μ L。标本先经95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性45 s, 55~57 ℃退火1~2 min 后, 72 ℃延伸2~3 min, 共30~40个循环, 最后72 ℃延伸10 min结束反应, 置4 ℃保存。HCMV UL54基因扩增时分别以表2的4对引物与待检标本DNA反应, 反应条件基本同HCMV UL97基因扩增, 总反应体积为50 μ L。

表1 HCMV UL97基因扩增引物序列
表2 HCMV UL54基因扩增引物序列

4. HCMV耐药相关基因扩增产物的纯化与分析 将PCR扩增产物再经低熔点琼脂糖电泳, 割胶并利用DNA回收试剂盒纯化回收阳性目的条带, 送上海英俊生物技术有限公司进行测序, 最后使用DNA star 软件对所获结果同标准序列进行比对分析。

结 果
一、HCMV耐药相关基因的扩增

1.HCMV UL97基因扩增 采用巢式PCR直接扩增HCMV感染患者的外周血白细胞和阳性野生型HCMV AD169 UL97基因产物, 分别得到不同长度的特异性条带, 即2 254、1 049和776 bp, 与预期结果一致。分离病毒株患者的同步外周血白细胞的检测结果也与之符合。见图1。

图1 HCMV UL97基因扩增产物电泳图

2. HCMV UL54基因扩增 分别使用Set 1、2、3、4引物与HCMV AD169株DNA模板反应获得4 条特异性条带, 长度分别为654 、617 、602 和661 bp。其结果显示产物大小符合预期。见图2。

图2 HCMV UL54基因扩增产物电泳图

二、临床分离毒株UL97的基因型序列与其GCV耐受性测序分析

将收集的HCMV 感染患者外周血分离白细胞, 提取DNA, 直接经巢式PCR扩增, 并经过核酸测序与比对后显示, 外周血标本的检测与分离毒株的检测分析一致, 提示无需病毒分离, 可直接利用耐药基因型检测获得其耐药相关基因型。见表3。33株临床分离毒株的UL97基因型与其对GCV耐药表型的结果相符。

表3 HCMV临床分离株的GCV敏感性测定结果
讨 论

病毒耐药相关基因型分析可以直接测定与耐药相关的病毒基因。通过对国际上公认的针对GCV耐药基因型主要位于HCMV UL97和UL54 2个基因片段设计了7对引物, 分别包括UL97基因全长序列2 254、1 049(位于403~753)和776 bp(位于438~697); UL54基因全长序列位于900~3 000, 分成4个基因片段, 即654、617、602和661 bp。经巢式PCR扩增, 其产物的电泳结果显示7个条带的相对分子质量符合目的基因的大小, 测序结果使用DNA star 软件分析, 表明与病毒基因文库标准一致。33份临床外周血白细胞直接检测分析的结果与临床分离病毒株检测结果符合, 提示病毒耐药基因型分析可供分析国际上已确认的HCMV 已知耐药基因型和新的突变[4]。此方法既可适用于病毒培养后, 也可适用于临床标本的直接检测。

相比表型分析, 耐药基因型分析可以直接检测临床标本[5], 从而大大缩短了检测时间, 无需病毒分离步骤, 可以有效地降低实验室相应技术平台要求和可能因为临床用药或实际检测时药物的选择性而导致的耐药检测偏差。

随着研究的深入, 新型耐药突变点的出现[6], 以及UL97基因和UL54基因单独或联合突变对耐药形成作用的逐步明朗化, 本研究仅立足对UL97基因的相关调研是不够的, 况且对于发现的新型基因突变型是耐药相关突变还是无意义突变也是期待解决的关键问题。我们目前初步的经验是, 可以通过观察患者HCMV DNA水平的动态变化, 即曾因为临床用药使得病毒DNA拷贝数下降呈低水平, 而后又出现反跳上升, 亦即病毒学突破(viral breakthrough), 提示耐药现象产生的可能[7]。最终还是需要适当实验室病毒分子转移技术, 通过重组病毒的耐药性检测来验证。

应用耐药基因型分析结合耐药表型, 对我国目前HCMV 耐药现状展开调查, 不仅有助于临床诊治的药物筛选, 促进个性化用药[8], 而且对于新药的筛选、控制耐药株的产生与传播等具有重要意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Chou S, Waldemer RH, Senters AE, et al. Cytomegalovirus UL97 phosphotransferase mutations that affect susceptibility to ganciclovir[J]. J Infect Dis, 2002, 185(2): 162-169. [本文引用:1]
[2] Pancholi P, Wu F, Della-Latta P. Rapid detection of Cytomegalovirus infection in transplant patients[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2004, 4(2): 231-242. [本文引用:1]
[3] Lurain NS, Weinberg A, Crumpacker CS, et al. Sequencing of Cytomegalovirus UL97 gene for genotypic antiviral resistance testing[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(10): 2775-2780. [本文引用:1]
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[6] Boivin G, Goyette N, Gilbert C, et al. Absence of Cytomegalovirus-resistance mutations after valganciclovir prophylaxis, in a prospective multicenter study of solid-organ transplant recipients[J]. J Infect Dis, 2004, 189(9): 1615-1618. [本文引用:1]
[7] Chou S. Antiviral drug resistance in Human cytomegalovirus[J]. Transpl Infect Dis, 1999, 1(2): 105-114. [本文引用:1]
[8] 季育华, 王祥慧. 移植领域中人CMV 感染的关注点与对策[J]. 中华器官移植杂志, 2008, 29(3): 188-189. [本文引用:1]