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翁文浩综述, 李智审校. 甲基化CpG结合蛋白2在肿瘤发生中的作用研究. 2009, 24(8): 622-625
  
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甲基化CpG结合蛋白2在肿瘤发生中的作用研究
翁文浩综述, 李智审校
同济大学附属第十人民医院检验科,上海 200072

作者简介:翁文浩,男,1982年生,学士,技师,主要从事分子生物学研究。

摘要
关键词: 甲基化CpG结合蛋白2; 表观遗传学; 肿瘤
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-0622-04

表观遗传学主要从基因组修饰的角度来研究基因表达的调控机制, 其中最具代表性的就是DNA甲基化, 这也是目前胚胎学、肿瘤生物学关注热点。在哺乳动物中, DNA 甲基化主要发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG)第五位碳原子上, 即5-甲基胞嘧啶(5-mC)。甲基化的CpG岛可产生阳性信号导致相关基因沉默。在不同组织或细胞不同发育阶段, 基因组DNA上各CpG位点甲基化状态差异构成了基因组DNA 甲基化谱, 异常DNA 甲基化会导致肿瘤发生。

甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG-binding domain , MBD)家族是一类与甲基化CpG二核苷酸结合的核蛋白, 家族成员含有共同的MBD结构域, MBD2作为该家族成员, 能有机地将DNA甲基化和组蛋白修饰藕联起来, 在表观遗传学中发挥中枢纽带作用, 并与细胞调控、组织发育及肿瘤形成有着密切关系。为此, 我们就MBD2在肿瘤发生中的作用及其研究进展作一综述。

一、MBD2的生物学特征和功能

近年来发现碱基的修饰能够稳定储存和传递遗传信息, 这种以非序列改变所致基因表达变化为主要研究内容的学科称为表观遗传学, 其中最具代表性的就是DNA甲基化。目前, 启动子区CpG岛甲基化导致基因转录沉默已成为不争的事实, 然而细胞是通过什么方式来翻译并传递特定CpG岛甲基化决定的基因表达信息, 并最终导致基因转录沉默呢?MBD家族就是这类阅读和翻译表观遗传信息的媒介分子, 现已发现MBD家族成员有MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3及MBD4。MBD2作为MBD家族的重要成员, 参与并维持了DNA甲基化早期及后续的生物学效应。

MBD2基因定位于18q21, 含有6个编码外显子和1个3'非编码外显子, 在内含子2区域内还存在一个睾丸特异性外显子。MBD2编码蛋白有411个氨基酸, 从145位到213位氨基酸为甲基CpG结合结构域, 能与特定的甲基化序列结合。MBD2与MBD3在序列上存在很大同源性, 但MBD2有140个氨基酸残基的长N端, 这在MBD3中是不存在的。MBD2的这个区域是由重复的甘氨酸残基和精氨酸残基构成, 该区域功能目前还尚不清楚。与MeCP2相比, MBD2需要结合密度更高的甲基化序列, 并且能与半甲基化DNA链结合。MBD2存在2种不同的亚型, 即MBD2a和MBD2b, 二者在Hela细胞中都能表达为成熟蛋白质, MBD2a为全长411个氨基酸的MBD2, MBD2b与MBD2a相比, 在N端缺失150个氨基酸。在睾丸中, MBD2选择剪接第三外显子使之表达更短的型别。

MBD2[1]认为是MeCP1复合体的组成部分, 在体外能够招募核小体重塑及组蛋白去乙烯化酶(nucleosome remodeling and histone deacetylase, NuRD)结合至甲基化DNA, 从而使染色体结构发生改变, 抑制基因转录。Feng等[2]在对MeCP1复合体的研究中发现, 纯化后的MeCP1复合体含有10种主要多肽, 包括了MBD2和所有已知的NuRD成分, 由此可以推测MBD2将核小体重塑、组蛋白去乙酰化与DNA甲基化联系了起来。在果蝇MBD2[3]的研究中也发现了MBD2是NuRD共有成分, 并且能与果蝇NuRD复合体中p55、MI-2亚基发生特殊作用。

部分研究认为MBD2还具有去甲基化酶活性。体外研究发现[4]将MBD2构建的表达载体转染至HEK293细胞, 使MBD2瞬时表达, 2种启动子区甲基化的报告基因pSV40-CAT和pGL2T+I4xTBRE出现了重新转录现象, 并且呈现出时间和剂量效应, 提示了MBD2能够使启动子区mCpG二核苷酸去甲基化, 恢复基因转录功能。然而MBD2去甲基化酶活性具有一定特异性, p19-ARF启动子在MBD2过度表达后仍然保持甲基化状态。

MBD2可与相关转录因子相互作用, 共同构成信号网络, 这使得人们对以MBD2参与的甲基化信号途径认识更加深入。见表1。此外, 有研究发现[11]MBD2表达受到精氨酸甲基化的控制, 研究表明:一种精氨酸甲基转移酶能够催化MBD2精氨酸的甲基化减少了MBD2-甲基化DNA复合体和MBD2-组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)复合体的形成, 削弱MBD2在细胞中的转录抑制功能。

表1 MBD2相互作用蛋白因子一览
二、MBD2与肿瘤的发生

大量研究表明, 在肿瘤的发生和发展中存在DNA 甲基化水平和模式的混乱, 包括整体基因组甲基化水平过低和局部基因启动子区域甲基化过高。MBD2作为偶联DNA甲基化和组蛋白修饰的重要媒介分子必然参与肿瘤形成。目前, MBD2的表达水平和肿瘤风险、侵袭性之间的关系并没有作出明确判断。有研究指出, 检测MBD2表达水平时, 参考基因选择不同, 相对定量结果会得出不同结论。在人类肺癌细胞系和正常肺组织的比较中发现, 当转录产物水平以β -actin标准化之后, MBD2明显升高, 但是, 当mRNA的水平用细胞增值标记物(PCNA)标准化之后, 这种表达差异就消失了。因此, Sato等[12]推断MBD2的升高可能只是一种肿瘤细胞增殖的表现。

1.MBD2与消化系统肿瘤

在胃癌研究中, Oue等[13]发现MBD2在肿瘤细胞中都低表达。DNA甲基化转移酶 (DNA methytransferase , DNMT)1、DNMT3A、DNMT3B、MBD2 mRNA与肿瘤分期和组织类型无关, 并且发现DNA错配修复基因(hMLH1)、p16(INK4a)和钙粘素基因(CDH1)的甲基化状态与DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、MBD2无关。Bakker等[14]在肝细胞癌中发现, 肝细胞癌谷胱甘肽转移酶P1(GSTP1)由于启动子区域甲基化发生基因沉默, 通过染色质免疫沉淀技术(ChIP)发现MBD2结合于该启动子区域, 通过siRNA技术和体外转染含有GSTP1甲基化启动子序列的载体质粒, 证实了MBD2对GSTP1起到了基因沉默作用。Schmidt[15]等在对结肠癌的研究中发现DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、MBD2都上调, DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在癌组织中的表达比癌旁正常组织高2~3倍, 推断MBD2作为去甲基化酶虽然在肿瘤中有上调, 但其作用无法抵消甲基化酶活性, 从而导致肿瘤的发生。

2.MBD2与前列腺癌

Samir等[16]研究发现, MBD2活性在前列腺癌细胞株中是缺失的, 而良性增生细胞株BPH-1是正常水平。免疫组化实验表明, 前列腺癌组织几乎无MBD2表达, 良性增生组织低表达。提示了MBD2的去甲基化功能在前列腺癌中被抑制。Shukeir等[17]用MBD2反义寡核苷酸(MBD2-AS)处理PC3细胞, 结果对尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和血管生成因子表达出现了剂量和时间依赖性的抑制作用, 降低了肿瘤细胞在体外的侵袭性, 而在一些晚期甲基化基因的表达没有任何变化, 如GSPT1和雄激素受体(andogen receptor, AR)。在老鼠的腹部灌入MBD2-AS处理的PC3细胞结果发现肿瘤体积要明显小于没有经过处理的PC3细胞。免疫组化显示MBD2-AS能够有效降低肿瘤uPA和MMP-2表达。

3.乳腺肿瘤

研究发现MBD2在乳房癌组织与正常癌组织之间的表达没有明显差异, 而MeCP2高表达和雌激素受体基因高甲基化则与乳腺癌发生高度相关[18]。

4.膀胱肿瘤

Zhu等[19]发现了MBD2是膀胱癌的保护因素, 在98例膀胱癌患者中, 与同类对照组比较, MBD2能够降低膀胱癌发生的危险性, 这种保护作用尤其表现在女性、老年和吸烟引起的异常甲基化, 从而有效防止肿瘤发生。

5.其他

研究者在一系列肿瘤细胞系中发现MBD2介导诸如BTG3、p14/p16、14-3-3sigma、ABCG2、BubR1等多个抑癌基因的甲基化[20~24], 对肿瘤异常表观调控起到了重要作用。

三、MBD2与肿瘤基因治疗

人们在研究MBD2蛋白过程中发现MBD2蛋白是一个理想的基因治疗靶点。Owen等[25]在ApcMin/+小鼠模型(ApcMin/+小鼠肿瘤抑制基因Apc存在杂和突变, 该基因很容易诱导形成结肠癌)的基础上构建了MBD2-/-、MBD2+/-小鼠即获得了MBD2纯和, 杂和以及野生型小鼠, 并同时存在Apc杂和突变。研究发现ApcMin/+MBD2-/-的小鼠存活的时间要明显长于对照ApcMin/+ MBD2+/+小鼠, 而ApcMin/+MBD2+/-的小鼠表现中等生存期。这表明MBD2基因剂量对于肿瘤抵抗十分关键。进一步研究发现ApcMin/+MBD2-/-小鼠的肿瘤数量和大小显著减少, 并且MBD2-/-的小鼠能够存活和生育, 这使得MBD2成为肿瘤治疗的潜在靶位。随后的研究中, Campbell等[26]开发了序列特异的MBD2反义抑制剂, 此类试剂能够抑制锚定生长的人类肺癌(A549)和结肠癌(HCT116)细胞株体外生长以及移植后的肿瘤生长, 并且该类反义寡核苷酸并不抑制正常细胞生长, 也无明显体内毒性。Ivanov等[27] 通过MBD2-AS和博莱霉素的联合使用增强了抗肿瘤作用。尽管目前MBD2缺失能够抑制肿瘤发生的确切机制还不十分清楚, 但在其基础上开发的基因治疗却效果显著, 进一步研究还有待深入。

四、结语

在基于蛋白组学、基因功能组学的后基因组时代, 表观遗传学将成为一门不可小视的主流学科。由于肿瘤表观遗传改变是广泛且复杂的, 目前的研究也只是冰山一角。MBD2蛋白在肿瘤异常DNA甲基化中扮演着重要角色, 但对MBD2具体效应机制和调节方式仍存困惑之处:如对MBD2去甲基化活性的研究、与MBD2相互作用的核因子、MBD2作用基因谱等。随着分子生物学新技术应用以及肿瘤DNA甲基化深入研究, 这些问题会在不久将来得以阐明, 这使得人们对肿瘤表观遗传学紊乱机制认识以及攻克肿瘤征程中前进一大步。

The authors have declared that no competing interests exist.

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