引用本文
段祥, 王翠玲, 王增松, 谢飞群, 揭燕, 夏书奇, 曾振飞, 李茹冰, 傅泳航, 张宜俊. 重组人白细胞介素12对健康人外周血单个核细胞产生γ干扰素影响的研究. 2009, 24(8): 586-590
DUAN Xiang, WANG Cuiling, WANG Zengsong, XIE Feiqun, JIE Yan, XIA Shuqi, ZENG Zhenfei, LI Rubing, FU Yonghang, ZHANG Yijun. Study on the influence of recombinant human interleukin-12 inducing the interferon-γ production of PBMC from healthy subjects. Labratory Medicine, 2009, 24(8): 586-590  
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重组人白细胞介素12对健康人外周血单个核细胞产生γ干扰素影响的研究
段祥1, 王翠玲1, 王增松1, 谢飞群1, 揭燕1, 夏书奇1, 曾振飞1, 李茹冰2, 傅泳航2, 张宜俊1
1. 广州市恺泰生物科技有限公司,广东 广州 510620
2. 解放军第458医院检验科,广东 广州 510602

作者简介:段 祥,女,1977年生,硕士,主要从事乙型肝炎和肿瘤治疗性生物药物的研究。

通讯作者:张宜俊,联系电话:020-87535885。

摘要
目的

建立重组人白细胞介素12(rhIL-12)的生物活性检测方法,观察rhIL-12诱导健康人外周血单个核细胞(PBMC)产生γ干扰素(IFN-γ)的水平与剂量和时间之间的关系,揭示其变化规律。

方法

rhIL-12供试品刺激健康人PBMC分泌IFN-γ,经国际标准品校正,建立rhIL-12生物活性测定方法。以1 ng/mL浓度rhIL-12诱导健康人PBMC,分别于24、48、72、96和120 h 5个时间点用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清的IFN-γ水平。测定0.1、0.5和2.5 ng/mL 3个浓度rhIL-12诱导人PBMC 72 h后培养上清的IFN-γ水平, 用Prism 5.0统计软件的重复测量方差分析法对所得数据进行统计学处理。

结果

rhIL-12供试品的生物活性曲线呈典型S型,IFN-γ含量为最大浓度一半时的供试品浓度(ED50)为(1.008±0.238) ng/mL,供试品rhIL-12效价为7 938 IU/mL。测定1 ng/mL浓度rhIL-12刺激健康人PBMC后5个时间点培养上清中IFN-γ显示,不同个体高峰出现时间有所不同,在高峰出现前均呈现递增趋势。高、中、低3个浓度rhIL-12分别诱导健康人PBMC产生的IFN-γ水平与浓度之间呈显著量效关系,且在 0.1 ng/mL的极低浓度即可诱生高水平IFN-γ。

结论

rhIL-12供试品生物活性良好,与国际标准品比对基本一致,不同人群对rhIL-12的应答高峰存在个体差异,以诱生IFN-γ作为评价rhIL-12生物活性的指标具有明显的量效关系。

关键词: 重组人白细胞介素12; γ干扰素; 细胞免疫
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-0586-05
Study on the influence of recombinant human interleukin-12 inducing the interferon-γ production of PBMC from healthy subjects
DUAN Xiang1, WANG Cuiling1, WANG Zengsong1, XIE Feiqun1, JIE Yan1, XIA Shuqi1, ZENG Zhenfei1, LI Rubing2, FU Yonghang2, ZHANG Yijun1
1. The Kaitai Biological Technology Company Limited,Guangdong Guangzhou 510620, China
2. Department of Clinical Laboratory, the 458th Hospital of People's Liberation Army,Guangdong Guangzhou 510602, China
Abstract
Objective

To establish a method for detecting bioactivity of recombinant human interleukin-12 (rhIL-12) in order to observe the relationship between induction dose/time and the level of interferon-γ (IFN-γ) in the trials of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects which were induced by rhIL-12, and reveal the change rules.

Methods

The tested rhIL-12 was used for stimulating PBMC from healthy subjects to produce IFN-γ. The method for detecting rhIL-12 bioactivity was established after calibrating by international standard rhIL-12. The IFN-γ levels in culture supernatant of PBMC from healthy subjects which were stimulated by 1 ng/mL rhIL-12 at 5 time points of 24, 48, 72, 96 and 120 h were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The IFN-γ levels in culture supernatant of PBMC in response to 0.1, 0.5 and 2.5 ng/mL rhIL-12 72 h stimulation were determined, respectively. The statistical analysis of data were performed by one-way analysis of variance with Prism 5.0.

Results

An S-curve of tested rhIL-12 bioactivity could achieve. 50% effective dose (ED50) was (1.008±0.238) ng/mL, and the potency of tested rhIL-12 was 7 938 IU/mL. The IFN-γ levels detected in culture supernatant of PBMC from healthy subjects in response to 1 ng/mL rhIL-12 stimulation at 5 time points indicated that IFN-γ peak values in different subjects showed up at varied times with increasing tendency before the summit forming. There was a significant dose-effect correlation between IFN-γ production of PBMC from healthy subjects and the high dose, middle dose and low dose of rhIL-12. Furthermore, a very low dose of 0.1 ng/mL also could induce high IFN-γ level.

Conclusions

The bioactivity of tested rhIL-12 is good, which is almost identical with that of international standard rhIL-12. There are individual variations among different people in response to rhIL-12 stimulation and there is a significant dose-effect correlation, evaluating the bioactivity index of rhIL-12 with induced IFN-γ.

Keyword: Interleukin-12; human; recombinant; Interferon-γ; Immunity; cellular

近年来, 白细胞介素12(IL-12)在细胞免疫和抗肿瘤中的作用受到越来越多的关注。IL-12是一种相对分子质量为75 000的糖蛋白, 是由35 000的轻链(p35, IL-12α )和40 000的重链(p40, IL-12β )组成的异源性二聚体, 由多个二硫键连接。IL-12是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的多功能细胞因子, 在免疫网络中占有十分重要的地位。IL-12能调节辅助性T细胞(Th)1/Th2应答, 使其向Th1倾斜, 诱导Th1细胞发育和增殖[1]; 较低浓度的IL-12即可以诱导自然杀伤(NK)细胞和T细胞产生γ 干扰素(IFN-γ ), 增强其细胞增殖和溶细胞的能力, 产生细胞免疫[2]。此外, IL-12在IFN-γ 诱导基因和淋巴-内皮细胞交叉调控的介导下, 能够诱导抗血管生成作用。IL-12的免疫调节和抗血管生成作用是其作为抗病毒和抗肿瘤药物使用的理论依据。我们对重组人IL-12(rhIL-12)的生物活性进行初步研究, 并探讨其临床应用价值。

材料和方法
一、材料

1.研究对象 健康志愿者10名, 其中男6名, 女4名, 年龄23~33岁。

2.试剂 供试品rhIL-12(广州市恺泰生物科技有限公司, 批次20080611), rhIL-12 国际标准试剂购自英国国家生物标准与检定所(NIBSC), RPMI-1640(GIBCO, 美国), 胎牛血清(GIBCO, 美国), Ficoll淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司), 抗人CD3-藻红蛋白(PE)(eBioscience, 美国), 人IFN-γ 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒、四甲基联苯胺(TMB)底物显色剂(BD-Pharmingen, 美国)。

3.仪器 SW-CJ-2F型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司), CO2培养箱 (SANYO, 日本), LXJ-Ⅱ 型离心机(上海医用分析仪器厂), Multiskan MK3酶标仪、Well wash 4 MK2洗板机(上海热电仪器有限公司), XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。

二、方法

1.人外周血单个核细胞(PBMC)分离 取受试者新鲜外周静脉血5 mL, 肝素20 U/mL抗凝, 经RPMI-1640 1∶ 1稀释后, 用Ficoll淋巴细胞分离液按常规方法分离PBMC, RPMI-1640洗涤2次后, 最终用RPMI-1640(1 mL, 含10%胎牛血清)悬浮细胞, 调整细胞浓度为2× 106/mL。用台盼兰检测细胞活力, 细胞活力> 95%以上备用。将细胞悬液加入96孔培养板中, 每孔100 μ L。

2.rhIL-12国际标准品与供试品的稀释 参照中国药品生物制品检定所方法[3], 将rhIL-12国际标准品用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释成160.00、40.00、10.00、2.50、0.165、0.039、0.010和0.002 ng/mL 8个浓度。rhIL-12供试品用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释成320.00、80.00、20.00、5.00、1.25、0.312、0.078、0.020和0.005 ng/mL 9个浓度用于进行生物活性检测, 用单一浓度1 ng/mL rhIL-12于不同时间诱导人PBMC产生IFN-γ ; 以0.1、0.5和2.5 ng/mL高、中、低3个rhIL-12浓度分别诱导人PBMC产生IFN-γ 。

3.IFN-γ 的诱生和测定 在加有PBMC悬液的96孔细胞板中, 每孔加入100 μ L不同浓度rhIL-12标准品或供试品, 每个浓度3个复孔, 并设生理盐水空白对照和抗人CD3阳性对照。置于37 ℃、5%CO2的培养箱中温育24、48、72、96和120 h后, 无菌条件下每孔收集50 μ L上清液, 测定上清液中IFN-γ 含量, 按人IFN-γ ELISA测定试剂盒说明书操作。

三、统计学方法

rhIL-12生物活性检测数据采用origin 7.5软件处理, 以Logistic回归方法对rhIL-12的剂量-效应数据进行拟合。根据IFN-γ 含量为最大浓度一半时的供试品浓度(ED50), 按以下公式计算效价:供试品效价=标准品效价× 标准品ED50/供试品ED50。rhIL-12诱导健康人PBMC产生IFN-γ 的水平与剂量和时间之间的关系的检测中, 用Prism 5.0统计软件的重复测量方差分析法对所得数据进行统计学处理。

结 果
一、rhIL-12生物活性的检测

健康人PBMC经rhIL-12体外刺激18 h后能够分泌大量的IFN-γ , 产生的IFN-γ 在一定范围内与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系, 见图1。ED50为(1.008± 0.238) ng/mL, 供试品rhIL-12效价为7 938 IU/mL。

图1 rhIL-12生物活性测定曲线

二、1.0 ng/mL浓度rhIL-12诱导健康人PBMC产生IFN-γ 在不同时间点的变化

使用rhIL-12(1.0 ng/mL)刺激健康人PBMC, 在5个不同时间点测定产生的IFN-γ 水平, 结果表明7名受试者高峰出现在72 h, 之后呈下降趋势, 到96 h后再次呈上升趋势, 而3名受试者产生IFN-γ 的高峰出现在96 h, 之后开始降低, 所有受试者的IFN-γ 高峰出现前均呈现递增趋势。见图2(其中4名受试者)。

图2 1.0 ng/mL浓度rhIL-12不同时间诱导健康人PBMC产生的IFN-γ

三、不同浓度rhIL-12诱导健康人PBMC产生IFN-γ 的量效关系

rhIL-12高、中、低3个剂量诱导健康人PBMC 72 h后产生的IFN-γ 水平有明显的量效关系(相邻剂量间P均< 0.05), 且与生理盐水对照组相比, 差异亦有统计学意义(P< 0.05)。见图3。

图3 不同浓度rhIL-12诱导健康人PBMC产生IFN-γ 的量效关系

讨 论

IL-12主要由单核巨噬细胞产生, B细胞、树突状细胞(dendritic cell, DC)、中性粒细胞和其他抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)也能够产生IL-12。IL-12能够通过非溶细胞途径, 强有力的诱导T细胞和NK细胞大量释放IFN-γ 和肿瘤坏死因子α (TNF-α )等细胞因子来抑制病毒复制或清除病毒。同时还通过专一的促进Th1细胞生成和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分化, 释放穿孔素、颗粒酶和Fas配体, 提升溶解感染细胞的功能, 增强CTL和NK细胞的细胞毒性作用来参与细胞免疫, 在治疗感染、肿瘤和自身免疫性疾病中起着重要作用。

IL-12既可以非常有效的直接诱导IFN-γ 的产生, 又可以通过与其他干扰素诱生剂如IL-2、有丝分裂原、T细胞上受体(TCR)-CD3、CD28的配体及NK细胞上的IL-2、CD26的配体协同作用而诱生IFN-γ [4]。IL-12和CD28协同能够诱导静息T细胞增生, 与亚适剂量IL-2共同作用或与乙型肝炎病毒(HBV)抗原共刺激, 能使抗原特异性的CTL增殖并表现叠加或倍增效应, 释放IFN-γ , 同时增加T细胞、NK细胞的细胞毒作用[5]。当抗原水平较低时, IL-12可以作为第3信号直接活化Th1产生细胞免疫应答[6]。而当机体再次遭遇相同抗原时, IL-12可以促进免疫记忆性细胞活化, 对抗原产生强烈的免疫反应, 通过杀伤感染的细胞和分泌细胞因子来清除病原微生物[7]。

诱导T细胞、NK细胞产生IFN-γ 是IL-12免疫效应的主要体现, 抗IL-12的抗体在体内外均可抑制IFN-γ 的产生, 表明IL-12是IFN-γ 产生的必要条件[8]。在本研究中, 以IFN-γ 为rhIL-12生物活性的主要评价指标, 首先建立rhIL-12生物活性的研究方法, 使用由低到高不同浓度供试品rhIL-12刺激健康人PBMC产生IFN-γ , 通过与国际标准品的比对, 绘制量效曲线, 呈典型的S型, 与国际标准品曲线基本一致, 确定rhIL-12的ED50为(1.008± 0.238) ng/mL。然后观察不同时间点rhIL-12诱生IFN-γ 水平的动态变化, 发现人群间产生IFN-γ 的高峰时间存在差异, 大部分受试者高峰位于72 h, 小部分位于96 h, 说明人群对rhIL-12的应答存在个体差异, 因此应该测定多个时间点IFN-γ 水平, 而不能只观察单个时间点上产生IFN-γ 的水平。同时从结果还可观察到, 高峰前IFN-γ 一直呈递增趋势, 高峰后呈下降趋势, 高峰位于72 h的受试者在96 h后IFN-γ 有再次升高现象, 而由于测定时间点有限, 高峰位于96 h的受试者中未观察到再次升高, 因此在以后的实验中应增加观察的时间点, 对IFN-γ 的变化规律进行进一步的研究。最后在有效剂量范围内选高、中、低3个有效浓度, 分别刺激上述实验中IFN-γ 位于72 h的受试者PBMC, 诱导产生IFN-γ , 结果表明rhIL-12浓度和产生的IFN-γ 水平之间存在明显的量效关系, 各个浓度和生理盐水对照之间差异均有统计学意义, 同时结果显示极低浓度(0.1 ng/mL)的rhIL-12就可以在体外诱生高水平的IFN-γ 。

目前大量研究表明, rhIL-12在抗病毒或抗肿瘤治疗上都有一定的疗效, 包括黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肉瘤、乙型肝炎、丙型肝炎和获得性免疫缺陷综合征等[9~11]。有学者通过转基因鼠的试验证实IL-12可以抑制HBV的复制[12], Chehimi等[13]研究发现IL-12缺乏是人类免疫缺陷病毒(HIV)相关免疫缺陷的重要原因, IL-12可显著增加HIV感染者NK细胞的细胞毒功能。Nastala等[14]报道了体内IL-12对鼠肿瘤的抗肿瘤和抗转移活性, Strasly等[15]发现IL-12能够激活淋巴细胞中抗血管生成途径, 这种抗血管生成作用可以直接影响肿瘤细胞中基因的表达, 使血管内皮细胞生成因子表达下降。

IL-12的抗肿瘤活性和抗病毒活性已经在临床实验中显示出来, 但其毒副作用在一定程度上限制了应用。IL-12的毒副作用与多种因素有关, 如剂量、给药途径、使用时间的安排等, 因此IL-12作为生物应答调节因子用于疾病的治疗仍需要进一步的研究。本研究对rhIL-12生物活性及其免疫效应与使用浓度和作用时间之间的关系进行了初步探索, 为rhIL-12进一步应用于临床提供了理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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