引用本文
周会祥, 朱建安, 韩峰, 谢福生, 江永青. 人血浆β淀粉样蛋白42 ELISA的建立及其临床初步应用. 2009, 24(8): 582-585
ZHOU Huixiang, ZHU Jian'an, HAN Feng, XIE Fusheng, JIANG Yongqing. Development of an ELISA method for the determination of human plasma amyloid protein β42 and study of its preliminary clinical application. Labratory Medicine, 2009, 24(8): 582-585  
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《检验医学》编辑部
人血浆β淀粉样蛋白42 ELISA的建立及其临床初步应用
周会祥1, 朱建安2, 韩峰1, 谢福生1, 江永青1
1. 九江学院附属医院检验科,江西 九江 332000
2. 深圳市安群生物工程有限公司,广东 深圳 518054

作者简介:周会祥,男,1963年生,主治医师,主要从事酶联免疫吸附试验的临床应用研究。

通讯作者:朱建安,联系电话:0755-26456250。

摘要
目的

建立人血浆中β淀粉样蛋白42(Aβ42)酶联免疫吸附试验(ELISA),并初步观察其对诊断阿尔茨海默病(AD)的应用价值。

方法

用鼠抗Aβ42片段(1~28氨基酸残基)单克隆抗体包被微孔板,用生物素标记的兔抗Aβ42片段(40~42氨基酸残基)为标记抗体,应用生物素-亲和素系统(ABS)进行放大,采用棋盘滴定方法确定最佳实验条件,用Aβ42标准品建立ELISA标准曲线,分别检测不同痴呆程度AD患者及健康人血浆中Aβ42水平。

结果

本研究建立的方法测定范围为20~500 pg/mL,最低检出量20 pg/mL,批内和批间变异系数( CV)分别为3.8%和7.9%。轻度AD患者血浆中Aβ42水平为(146.4±9.7) pg/mL,明显高于健康对照组[(95.1±7.2) pg/mL],中晚期AD患者血浆Aβ42浓度明显下降[(99.4±17.6) pg/mL],其水平降至与健康对照组差异无统计学意义。

结论

建立的人血浆Aβ42 ELISA可作为AD早期诊断的有效方法,可在临床推广应用。

关键词: β淀粉样蛋白42; 酶联免疫吸附试验; 阿尔茨海默病
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-0582-04
Development of an ELISA method for the determination of human plasma amyloid protein β42 and study of its preliminary clinical application
ZHOU Huixiang1, ZHU Jian'an2, HAN Feng1, XIE Fusheng1, JIANG Yongqing1
1.Department of Clinical Laboratory,the Hospital Affiliated to Jiujiang College, Jiangxi Jiujiang 332000, China
2. Shenzhen Anqun Bioengineering Company Limited, Guangdong Shenzhen 518054, China
Abstract
Objective

To develop an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) of human plasma amyloid protein β42 (Aβ42)and study its preliminary clinical application in diagnosis of Alzheimer's disease (AD).

Methods

The microplate was coated with the mouse anti-Aβ42 fragments (1-28 amino acids) monoclonal antibody. The biotin-labeled rabbit anti-Aβ42 fragments (40-42 specific amino acids)antibody was adopted as labeling antibody.The sensitivity was amplified by avidin -biotin -system (ABS). The best reaction condition was decided by the board titration method . The standard curve of ELISA was established using Aβ42 standard product.The plasma Aβ42 level was detected in AD patients with different degree of dementia and in healthy people respectively.

Results

It was found that the measurement range of this method was 20-500 pg/mL,and the minimal detectable limit was 20 pg/mL, and the intra and inter-coefficients of variation ( CV) was 3.8% and 7.9%. The plasma Aβ42 level of the mild AD patients was (146.4±9.7) pg/ mL.It was significantly higher than the healthy group [(95.1±7.2) pg/mL]; The plasma Aβ42 level in the moderate or severe AD groups [(99.4±17.6)pg/mL]declined markedly, there was no significant difference compared with healthy control group.

Conclusions

The developed ELISA method for the determination of human plasma Aβ42 may become an effective method in early diagnosis of AD,and it could be useful in the clinical application.

Keyword: Amyloid protein β42; Enzyme-linked immunosorbent assay; Alzheimer's disease

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease , AD)是以进行性智能衰退为特征的神经变性疾病, 是引起老年痴呆最主要的原因[1]。近年来研究表明, β 淀粉样蛋白(Aβ )沉淀是构成老年斑(senile plaque, SP)的核心成分, 有很强的神经毒性。Aβ 通常以Aβ 42和Aβ 40 2种形式存在, 正常代谢过程中产生的主要是Aβ 40, 而AD患者中产生大量的Aβ 42, Aβ 42完整的C端是诱发细胞发挥毒性的肽段。Aβ 具有激活免疫炎性作用及细胞毒性, 能破坏血脑屏障功能, 使脑组织的大分子物质进入到血管内, AD病理研究也显示出, Aβ 斑块包绕的及附近的微血管有严重的血管淀粉样变现象, 血浆中Aβ 42检测可用来辅助轻度AD的诊断[2~5]。国内目前尚无相关检测产品推出, 为研制Aβ 42 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒, 本研究采用鼠抗Aβ 42片段(1~28氨基酸残基)单克隆抗体和生物素标记的兔抗Aβ 42片段(40~42氨基酸残基)特异性抗体, 应用生物素-亲和素系统(ABS)提高实验的敏感性和特异性, 建立测定Aβ 42的ELISA。

材料和方法
一、材料和试剂

纯种新西兰大白兔; 5~7周龄Balb/c小鼠; 生物素-亲和素(HMP)树脂(长沙大禹化工厂); 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、羊抗兔IgG、低相对分子质量糖蛋白(Tau蛋白)、四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶(HRP, 纯度≥ 3.0, 活力250 U/mg)(美国Sigma公司), 酶标微孔板(美国Sigma公司)。酶标仪(上海迅达医疗仪器公司); ABI431A型多肽自动合成仪(美国PSI公司); 隔热式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司, ); 液相色谱仪(上海天普分析仪器公司); 冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)。

二、2种相关抗原决定簇多肽片段的制备

用多肽自动合成仪, 通过固相法合成抗原决定簇多肽。具体方法:称取HMP树脂100 mg, 取代当量是1.0 meq, 即0.1 mmol于多肽自动合成仪反应腔内, 由多肽自动合成仪自动将特定的氨基酸按不同的顺序联接起来(多肽片段1:Aβ 42N端1~28个氨基酸在N端、C端分别加上Tyr; 多肽片段2:Aβ 42 N端特异性的40~42个氨基酸在40前加上D、R、Y), 偶联率达99%。用三氟乙酸切割肽链, 用乙二胺四乙酸(EDTA)、硫代苯甲醚和H2O作清除剂, 在室温下反应3 h, 除去切割试剂, 再用乙醚萃取, 得到Aβ 42多肽的粗品。高效液相色谱法分离纯化多肽。

三、Aβ 42(1~28氨基酸残基)抗原及鼠单克隆抗体的制备

用碳二亚胺法将上述多肽片段1与载体蛋白— — 血蓝蛋白(KLH)联接制备成抗原。免疫方案为取抗原与弗氏完全佐剂(基础免疫)和弗氏不完全佐剂(加强免疫)充分乳化后免疫Balb/c小鼠, 腹腔注射, 每次剂量为50~200 g/mL, 分20点皮内注射, 共免疫4次, 末次免疫后的第10天取耳血用ELISA测定抗体效价, 测得抗体效价达到1∶ 32 000以上。接种H22肝癌细胞于腹腔内, 取腹水并分离上清, 硫酸铵沉淀后经荧光素标记重组纯化蛋白(Protein G)亲和纯化。得到纯化的IgG, 分装后冻干, 低温保存。

四、Aβ 42(40~42氨基酸残基)抗原及兔抗Aβ 42多克隆抗体的制备

用碳二亚胺法将上述多肽片段2与载体蛋白KLH联接制备成抗原。免疫方案为取抗原与弗氏完全佐剂(基础免疫)和弗氏不完全佐剂(加强免疫)充分乳化后免疫新西兰大白兔背部, 剂量注射免疫数及抗体效价测定均同“ 材料和方法三” , 测得抗体效价达到1∶ 32 000以上。颈动脉插管取血, 分离血清。硫酸铵沉淀后经Protein G亲和纯化, 得到纯化的IgG, 分装后冻干, 低温保存。

五、Aβ 42 ELISA 试剂盒的制备和考核

1.包被条件的确定 包被条件包括:磷酸盐缓冲液(PBS)的pH值、包被的时间和包被抗体浓度。本研究选择不同包被条件和不同稀释度的抗体, 经棋盘滴定试验确定最佳包被条件。

2.包被步骤 将纯化的鼠单克隆抗体采用0.1 mol/L pH值7.2的PBS稀释不同倍数, 加于酶标板孔中进行包被(100 μ L/孔), 4 ℃过夜。取出包被液, 用0.1 mol/L pH值7.2的PBS冲洗5次。控干洗涤液, 加入1% 小牛血清(BSA)包被液, 每孔100 μ L, 4 ℃封闭16 h, 吸出包被液, 将包好的板条密封, 置4 ℃冰箱中保存备用。

3.包被板稳定性试验 将包被好的孔板分别于37 ℃放置2、3和4 d; 4 ℃冰箱内放置4、6和8个月。用ELISA测定包被板的抗体活性变化。

4.ELISA的建立 采用ABS-ELISA。取已包被的微孔板, 每孔加标准品或标本100 μ L, 37 ℃反应1 h, 洗板拍干; 每孔加生物素标记的兔单克隆抗体100 μ L, 37 ℃反应0.5 h, 洗板拍干; 每孔加亲和素标记的HRP 100 μ L, 37 ℃孵育0.5 h, 洗板拍干; 每孔加A、B显色剂各50 μ L, 振荡混匀, 37 ℃反应15 min; 最后每孔加入终止液50 μ L终止反应。450 nm测定吸光度(A)值, 根据标准品结果制得的曲线, 得出标本中Aβ 42的含量。

5.方法学考核 敏感性:按x0+2s计算。特异性:50%转换法计算交叉反应率。准确度:任取一份血清标本, 测定其基值后, 分别加入0、31.3、62.5、125和250 pg/mL的标准品, 再次测定, 计算回收率。精密度:测定批内和批间变异系数(CV)。准确性:通过平行性试验, 将2份AD患者EDTA血浆标本倍比稀释(稀释比分别为1∶ 1、1∶ 2、1∶ 4和1∶ 8)后检测其浓度值。

六、初步临床应用

AD患者68例, 为2008年九江学院附属医院神经内科患者, 经简易智力状态检查表(MMSE) 及临床痴呆程度量表(CDR) 检测, 确定轻度AD患者35例, 中晚期患者33例。健康对照组标本采自体检健康者47名, 取 EDTA抗凝血, 分离血浆保存待测。

七、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行处理, 所有实验数据用 x̅± s表示, 分析方法为方差分析和χ 2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、抗体的质量鉴定

1.抗体效价的测定 2种抗体效价均达到1∶ 32 000以上。

2.抗体亲和力的测定 鼠抗体亲和力常数(Ka)=1.35× 1010 L/mol, 兔抗体Ka=1.42× 1010 L/mol。

3.抗体特异性的检测 纯化后的抗Aβ 42寡肽抗体与Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白均无交叉反应。

二、反应条件的选择

经ELISA各种反应条件的滴定试验, 确定2种抗体的工作稀释液为0.1 mol/L, pH值7.2; 最佳包被时间为4 ℃冰箱放置过夜; 最适抗体包被稀释度为1∶ 10 000。

三、包被板稳定性试验

经用ELISA测定, 证实包被板在37 ℃下放置4 d、4 ℃下放置8个月的抗体活性与新包被抗体活性无明显差异。

四、标准曲线

用酶标仪对不同浓度的标准品按建立的ELISA进行测定, 结果用自动分析软件进行处理, 绘制标准曲线, 见图1。根据标本的A值可由标准曲线查出相应浓度。

图1 Aβ 42相应浓度A值的标准曲线

五、方法学考核

敏感性为20 pg/mL; 基质效应显示, 回收率为96.3%~104.2%, 平均回收率为100.2%; 不精密度显示, 批内CV=3.8%, 批间CV=7.9%; 准确性显示, 血浆中Aβ 42含量随稀释比例的增加, 所测定Aβ 42含量呈比例下降。见图2。

图2 2种不同浓度Aβ 42检测结果与稀释倍数的关系

六、与美国英杰(Invitrogen)MS ABETA 42 ELISA 试剂盒测定值比较

115名受试者的血浆标本同时用2种试剂盒进行测定, 检测结果见图3, 两者基本吻合。Y=1.004 6X+0.171 1, r=0.999。

图3 本法与英杰ELISA试剂盒测定结果比较

七、初步临床应用

115份不同受试者血浆标本按临床诊断结果分为健康对照组、轻度患者和中晚期患者, 正常参考范围按健康对照组的 x̅± 1.96s计算, 为81.0~109.2 pg/mL, 各组的Aβ 42测定结果见表1。

表1 115份血浆标本Aβ 42测定结果

轻度AD患者血浆Aβ 42水平明显高于健康对照组, 中晚期AD患者血浆Aβ 42水平明显下降, 与健康对照组差异无统计学意义。轻度AD患者Aβ 42阳性率为94.29%, 中晚期AD患者的阳性率为27.27%, 与健康对照组(阳性率4.25%)相比, 差异有统计学意义(P< 0.05)。

讨 论

Aβ 在脑组织沉积, 并逐步形成SP和神经元纤维缠结(NET), 是AD的最主要病理特征[6~8]。Aβ 的2种形式中, Aβ 40在正常老年人和AD患者脑内均有, 而Aβ 42主要见于AD患者脑内, 是一种不溶性肽, 较Aβ 40更易聚集, 因此Aβ 沉积开始于Aβ 42而非Aβ 40。AD时人淀粉样前体蛋白(APP)异常代谢导致 Aβ 42升高, 所以针对Aβ 42的检测对AD的诊断有一定的实用价值[9]。 本法原材料选用了Aβ 42 N末端的特异性抗原决定簇多肽, 使测定针对血浆Aβ 42具有高度特异性。本研究使用ABS对结果进行了放大, 使测定结果更为灵敏。

本研究结果显示, 由本研究研制的Aβ 42 ELISA检测的35例轻度AD患者有33例血浆中Aβ 42水平高于正常参考上限值, 分析原因可能是轻度AD患者由于代谢异常, 体内APP主要分解产物Aβ 42/Aβ 40比值升高, 在轻度AD患者中可检测出血浆中Aβ 42量的升高; 而随着病情发展, Aβ 42沉积形成SP, 血浆中可检出的Aβ 42有很大程度的降低, 使得中晚期AD患者Aβ 42检测值明显降低, 33例严重AD患者结果仅有9例超过正常参考值, 且该组测定结果平均值接近于正常对照组水平, 差异无统计学意义。本法的测定值与美国英杰公司的Aβ 42 ELISA试剂盒测定值线性相关良好, 确认了本法的可行性和准确性。

迄今为止, 轻度AD的诊断十分困难, 首先需做脑脊液检查, 取材不方便, 其次是脑脊液中磷酸化的Tau蛋白和其他骨架蛋白增加无特异性[10]。本研究中AD患者病情为轻度时其血浆Aβ 42水平大幅升高, 中晚期则下降, 如果在AD发病初及发病过程中的不同阶段对Aβ 42进行追踪检测, 对AD的早期发现、早期诊断和病程监测有着重大意义。本研究结果还显示, 此方法具有较好的敏感性和特异性, 且血浆标本的检测相对于脑脊液检查来讲, 更方便, 可作为AD诊断有价值的实验室方法在临床推广应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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