引用本文
高云朝, 赵卫国. 光激化学发光法检测甲胎蛋白实验性能评价. 2009, 24(8): 578-581
GAO Yunchao, ZHAO Weiguo. Analytical performance of light initiated chemiluminescence assay for serum α-fetoprotein. Labratory Medicine, 2009, 24(8): 578-581  
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光激化学发光法检测甲胎蛋白实验性能评价
高云朝1, 赵卫国2
1.上海交通大学附属第六人民医院核医学科,上海 200233
2.博阳生物科技(上海)有限公司,上海 201210

作者简介:高云朝,男,1965年生,博士,主治医师,主要从事核医学专业研究。

摘要
目的

评价光激化学发光法(LICA)检测血清甲胎蛋白(AFP)的实验性能。

方法

利用定标品和质控品对LICA检测AFP的实验性能进行评价;利用358份含不同浓度AFP的血清标本对LICA和罗氏电化学发光免疫法进行方法学对比评价。

结果

LICA检测AFP的分析敏感性为0.25 μg/L,在平均浓度10和500 μg/L的检测总变异系数( CV)均<5%。与参比方法所测AFP浓度差异无统计学意义,2种方法所测结果的对数值呈直线相关( r=0.966, P<0.001),对标本阴、阳性分类差异无统计学意义( P=0.824),有较好的一致性( Kappa=0.886, P<0.001)。

结论

LICA检测AFP具有良好的检测性能;与罗氏电化学发光法具有类似的实验性能。

关键词: 光激化学发光法; 甲胎蛋白; 电化学发光免疫法
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-00578-04
Analytical performance of light initiated chemiluminescence assay for serum α-fetoprotein
GAO Yunchao1, ZHAO Weiguo2
[1. Department of Nuclear Medicine, the Sixth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China
2. Beyond Diagnostics (Shanghai) Company Limited, Shanghai 201210, China]
Abstract
Objective

To evaluate the analytical performance of light initiated chemiluminescence assay (LICA) for serum α-fetoprotein (AFP).

Methods

The analytical performance was evaluated with control and calibrator materials, and methodological comparison was carried out with electrochemiluminescence immunoassay using serum samples from 358 subjects with various concentration of serum AFP.

Results

The analytical sensitivity was 0.25 μg/L with total coefficient variation ( CV) of <5% measured at approximately 10 and 500 μg/L. The two methods had no significant difference in AFP concentrations with significant linear correlation ( r=0.966, P<0.001) for log transformed values, and also had no significant difference in sample classification ( P=0.824) with high consistency ( Kappa=0.886, P<0.001).

Conclusions

The LICA for AFP has very good analytical performance with diagnostic performance comparable with electrochemiluminescence immunoassay.

Keyword: Light initiated chemiluminescence assay; α-fetoprotein; Electrochemiluminescence immunoassay

近半个世纪以来, 临床化学微量免疫分析技术经历了从放射免疫分析、酶联免疫分析到化学发光免疫分析的革新和质的飞跃。上世纪90年代问世的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术(luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI)具有均相、免清洗的技术特点, 同时具有高敏感性和特异性等检测性能, 应用范围涵盖了常规临床免疫分析、信号传导、受体配体分析、基因检测和新药开发等多个领域[1~10]。国内研制成功了基于LOCI检测原理的光激化学发光法(light initiated chemiluminescence assay, LICA)检测设备和相关试剂。本研究拟对该方法检测血清甲胎蛋白(AFP)实验性能进行评价。

材料和方法
一、试验材料

链霉亲和素(SA)包被的感光珠(60 mg/L, 批号148)、生物素化抗AFP抗体(20 mg/L, 批号66)、抗AFP抗体包被发光珠(300 mg/L, 批号149)、AFP定标品(0、6、22、122、480、1 000 μ g/L, 批号071211; 标准参照物来源于中国药品生物制品检定所, 批号150542-0004)、质控品(批号070829)、白色不透明微孔板(96孔和384孔)、光激化学发光检测仪(LICA HT)。以上试剂和设备均由博阳生物科技(上海)有限公司提供。实验用血清为上海市第六人民医院核医学科留存的临床患者检测标本。参比方法选用电化学发光免疫法AFP试剂及配套设备(Elecsys 2010, Roche公司, 德国)。

二、LICA反应原理

生物素化抗AFP抗体、发光珠上包被的抗AFP抗体、待测标本或定标品或质控品中的抗原, 三者形成双抗体夹心结构, 加入SA包被的感光珠后, 形成感光珠-发光珠紧密连接。感光珠受680 nm激光照射使周围氧分子激发, 变成单线态氧(singlet oxygen, 1Δ gO2, 带有1个激发态电子的氧分子), 后者扩散至发光珠并传递能量, 发光珠发射520~620 nm荧光信号并由发光检测仪探测。此过程中, 单线态氧半衰期仅4 μ s, 在反应体系中只能扩散大约200 nm。故只有结合态发光珠才能获得单线态氧的能量而发光, 非结合态发光珠由于相距较远, 无法获得能量而不发光。发光信号强弱与夹心结构中AFP的量呈正相关, 借助于定标品建立相应的函数关系, 即可计算标本和质控品中AFP的浓度。

三、LICA反应程序

待测标本或定标品或质控品、抗AFP抗体包被发光珠、生物素化抗AFP抗体各15 μ L加入微孔板, 放入光激化学发光检测仪。仪器根据预先设定的程序进行混匀, 37 ℃温育20 min、加入SA包被感光珠60 μ L、37 ℃再温育15 min, 680 nm激光激发1 s, 延迟60 ms后在520~620 nm波长范围进行光强度检测1 s, 显示标准曲线和标本检测结果等信息。

四、实验性能评价

1.分析敏感性 零浓度定标品(小牛血清)重复测量5次, 求平均相对光单位(RLU), 按“ x̅+2s” 在标准曲线上反求浓度。共检测2块微孔板。

2.精密度 对低、高2个浓度质控血清连续检测11 d, 每天2批, 每批各重复测量5次(其中1批重复10次), 计算平均批内变异系数(CV)和总CV。

3.线性 高浓度AFP血清(936.1 μ g/L)用零浓度小牛血清作1∶ 20、1∶ 50、1∶ 80、1∶ 95、1∶ 99系列稀释, 各稀释点重复测量2次, 取平均值作图, 以各点实测平均浓度占期望值百分数计算回收率。

五、方法学比较

含AFP不同浓度的临床检测标本358份, 分别用Elecsys 2010电化学发光免疫法和LICA进行检测。根据前者分析敏感性0.61 μ g/L, 后者0.25 μ g/L, 更小的数值则分别记为“ < 0.61 μ g/L” 或“ < 0.25 μ g/L” , 为了能够进行统计运算, 均按“ 0.61 μ g/L” (2例)或“ 0.25 μ g/L” (17例)计算。

六、统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件, LICA AFP与Elecsys 2010 AFP测量值对数转换后进行配对t检验和直线相关与回归分析, 对标本阴、阳性分组的一致性检验采用McNemar检验。

结 果
一、标准曲线

LICA AFP各点定标品的发光值连续检测11 d, 每天2次, 共检测22批次。曲线拟合采用3次样条插值函数, 取均值后标准曲线见图1。图中误差棒代表“ x̅± 2s” 。各标准点总CV为4.96%~8.44%, r=0.999~1.000。

图1 LICA检测AFP标准曲线

二、实验性能评价

1.分析敏感性 2块微孔板RLU的“ x̅+2s” 分别为1 812和1 922, 反求浓度为0.22 μ g/L和0.27 μ g/L, 平均值0.25 μ g/L。

2.精密度 2个质控血清平均浓度分别为(10.69± 0.43) μ g/L和(499.97± 15.85) μ g/L。低值测量平均批内CV 3.2%(1.1%~6.9%), 总CV 4.1%; 高值测量平均批内CV 1.8%(0.5%~3.2%), 总CV 3.2%。

3.线性 高浓度AFP血清系列稀释曲线见图2, 直线相关系数(r)=-0.999(P< 0.001), 平均回收率为107.7%(97.4%~113.6%)。

图2 LICA检测AFP稀释曲线

三、方法学比较

1.浓度比较 原始测量值不符合正态分布, 取常用对数以后再进行配对t检验, 结果差异无统计学意义(t=0.921, P=0.358)。

2.相关性检验 将2种方法测量值取常用对数后[Elecsys 2010 (LogE)和LICA (LogL)]在直角坐标系中绘制散点图, 见图3。两者具有明显的直线相关趋势(r=0.966, P< 0.001); 直线回归方程为:LogE=0.233+0.737 LogL (r2=0.933, 方差分析F=4 925.3, P< 0.001, 回归方程成立)。

图3 Elecsys 2010 AFP对数值(LogE)与LICA AFP对数值(LogL)相关散点图

3.一致性检验 Elecsys 2010 AFP正常参考值为≤ 7 μ g/L, 当LICA AFP取正常参考值≤ 9 μ g/L时, 2种检测方法对标本的阴、阳性分组结果差异无统计学意义(P=0.824)。只有20例(5.6%)分组不符, 其中多数标本2种方法测量值非常接近, 见图3的2、4象限散点(垂直线和水平线分别表示正常参考值的对数值:Log9和Log7), 2种方法具有较好的一致性(Kappa=0.886, P< 0.001)。

讨 论

LICA检测原理源于LOCI技术, 最初由Ullman等[1]在1994年报道, 后由PerkinElmer公司生产相关试剂(AlphaScreenTM)。该技术采用了纳米级颗粒, 这不仅大大增加了生物分子的包被面积, 同时借助于SA-生物素放大系统, 使单位体积反应体系中含有更高浓度的生物分子, 为实现超高敏感性、减少标本和试剂用量奠定了基础。另外, 这种纳米颗粒在液相中保持稳定的悬浮状态, 并借助于“ 结合则发光” 原理, 实现了均相、免清洗检测[1, 2]。Ullman等[2] 检测促甲状腺激素(TSH)的分析敏感性为1.9 μ U/L; 批内CV为3.1%~5.2%, 与传统化学发光法相关性好(r2> 0.99)。Dafforn等[3]将TSH标本用量由常规的80 μ L减少至10 nL, 敏感性仍可达到2 pmol/L, 为实现高通量、多项目和小型化芯片检测技术奠定了基础。该法对血清促绒毛膜性腺激素(HCG)的可测范围为0.1~100 000 IU/L, 与传统化学发光法相关性好(r2=0.998)[3]。检测肌红蛋白和肌钙蛋白I也达到较高的敏感性和理想的精密度[9, 10]。

本研究对AFP检测结果显示, LICA较Elecsys 2010敏感性高(0.25与0.61 μ g/L), 并具有优越的精密度(总CV< 5%)和良好的健全性(回收率97.4%~113.6%)。与Elecsys 2010检测方法平行对比研究显示, 两者不但具有较高的相关性(r=0.966), 而且其检测浓度之间(P=0.358)及对标本阴、阳性分组(P=0.824)差异均无统计学意义, 表现为良好的一致性(Kappa=0.886)。

本研究未对血清干扰物进行研究。据文献报道, 该方法对可能存在的干扰物质, 如单线态氧淬灭物质(抗氧化剂、血红蛋白、维生素C等)、生物素结构类似物、总胆红素、三酰甘油等具有较好的耐受能力, 少数物质在较高浓度时的确存在干扰, 但在常规浓度情况下, 这些干扰作用可以忽略不计, 表现出较高的特异性[1, 2, 4, 9~12], 与参比试剂的一致性检验也间接证明了这一点。

总之, LICA以其独特的检测技术实现了均相、免清洗检测, 与传统免疫分析方法比较, 具有类似或更优越的检测性能, 是临床和科研工作者进行超微量检测分析的又一重要工具。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Ullman EF, Kirakossian H, Singh S, et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence[J]. Proc Natl Acad Sci, 1994, 91(12): 5426-5430. [本文引用:4]
[2] Ullman EF, Kirakossian H, Switchenko AC, et al. Luminescent oxygen channeling assay (LOCITM): sensitive, broadly applicable homogeneous immun-oassay method[J]. Clin Chem, 1996, 42(9): 1518-1526. [本文引用:3]
[3] Dafforn A, Kirakossian H, Lao K. Miniaturization of the luminescent oxygen channeling immunoassay (LOCI TM) for use in multiplex array formats and other biochips[J]. Clin Chem, 2000, 46(9): 1495-1497. [本文引用:2]
[4] Poulsen F, Jensen KB. A luminescent oxygen channeling immunoassay for the determination of insulin in human plasma[J]. J Biomol Screen, 2007, 12(2): 240-247. [本文引用:1]
[5] Patel R, Pollner R, Keczer S, et al. Quantification of DNA using the luminescent oxygen channeling assay[J]. Clin Chem, 2000, 46(9): 1471-1477. [本文引用:1]
[6] Beaudet L, Bedard J, Breton B, et al. Homogeneous assays for single-nucleotide polymorphism typing using AlphaScreen[J]. Genome Res, 2001, 11(4): 600-608. [本文引用:1]
[7] Peppard J, Glickman F, He Y, et al. Development of a high-throughput screening assay for inhibitors of aggrecan cleavage using luminescent oxygen channeling (AlphaScreenTM)[J]. J Biomol Screen, 2003, 8(2): 149-156. [本文引用:1]
[8] Wilson J, Rossi CP, Carboni S, et al. A homogeneous 384-well high-throughput binding assay for a TNF receptor using AlphaScreen technology[J]. J Biomol Screen, 2003, 8(5): 522-532. [本文引用:1]
[9] 马宏伟, 赵卫国, 潘柏申. 血清肌红蛋白光激化学发光免疫测定法的建立[J]. 检验医学, 2006, 21(1): 55-57. [本文引用:2]
[10] 马宏伟, 赵卫国, 潘柏申. 血清心肌肌钙蛋白I光激化学发光免疫测定法的建立[J]. 检验医学, 2007, 22(4): 398-401. [本文引用:2]
[11] Li Y, Choi M, Cavey G, et al. Crystallographic iden-tification and functional characterization of phosph-olipids as ligand s for the orphan nuclear receptor steroidogenic factor-1[J]. Mol Cell, 2005, 17(4): 491-502. [本文引用:1]
[12] Motola DL, Cummins CL, Rottiers V, et al. Identification of ligand s for DAF-12 that govern dauer formation and reproduction in C. elegans[J]. Cell, 2006, 124(6): 1209-1223. [本文引用:1]