引用本文
沈巍, 徐国宾, 张曼. 应用反相高效液相色谱内标法测定血清尿酸. 2009, 24(8): 568-574
SHEN Wei, XU Guobin, ZHANG Man. Determination of uric acid in human serum using a revered-phase high perfermance liquid chromatography. Labratory Medicine, 2009, 24(8): 568-574  
Permissions
Copyright©2009, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
应用反相高效液相色谱内标法测定血清尿酸
沈巍1, 徐国宾2, 张曼1
1 北京世纪坛医院临床检验中心,北京 100038
2 北京大学第一医院临床检验科,北京 100034

作者简介:沈 巍,1968年生,女,学士,主管技师,主要从事临床生物化学检验。

通讯作者:徐国宾,联系电话:010-66551122-2054。

摘要
目的

评价以5-氟尿嘧啶(5-FU)作内标的反相高效液相色谱(HPLC)测定血清尿酸(UA)的方法,拟初步推荐其作为血清UA测定的候选参考方法;并应用此方法评价常规酶比色法测定血清UA的结果偏倚。

方法

对测定血清UA的反相HPLC内标法进行方法学评价;通过测定有证参考物质(SRM)、参加国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)参考实验室考察活动,验证此方法的准确性及可靠性。以反相HPLC内标法为比较方法,以6种常用检测系统中的酶比色法作为实验方法,对61份血清样本进行测定。组成6个比对组,对每组比对数据作散点图、偏倚图,计算线性方程和相关系数( R2),进行偏倚评估。

结果

反相HPLC内标法测定UA线性范围达1 190 μmol/L,批内变异系数( CV)<2.1%,日间 CV<3.9%,绝对回收率为96.2%~101.0%,平均相对回收率为95.1%~99.4%。测定SRM的平均相对偏倚为-8.29%;测定IFCC参考实验室考察活动提供的样本,其结果与同位素稀释质谱(ID-MS)法的相对偏倚范围为-3.45%~-1.26%;在Beckman、Roche、Dade、Vitros封闭系统及Beckman、Roche开放系统中的酶比色法分别与反相HPLC内标法比较,各组中2种方法均相关良好( R2=0.996 9、0.997 2、0.995 2、0.996 7、0.997 3、0.994 7),在UA为120、470L、630 μmol/L时,预期相对偏倚范围分别为-14.6%~4.3%、-0.4%~8.0%、0.8%~8.8%,其中Beckman封闭系统测定结果与反相HPLC内标法的一致性好,Roche封闭系统低值偏低,Dade和Vitros封闭系统高值偏高,封闭系统比开放系统结果略好。

结论

拟推荐以5-FU为内标的反相HPLC法作为血清UA测定的候选参考方法。酶比色法在不同检测系统中所测结果存在一些差异。

关键词: 尿酸; 高效液相色谱; 有证参考物质; 参考实验室; 尿酸酶法
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)08-0568-07
Determination of uric acid in human serum using a revered-phase high perfermance liquid chromatography
SHEN Wei1, XU Guobin2, ZHANG Man1
1. Center of Clinic Laboratory, Beijing Shijitan Hospital, Beijing 100038, China
2. Department of Laboratory Medicine Science, Peking University Frist Hospital, Beijing 100034, China
Abstract
Objective

To evaluate the revered-phase high performance liquid chromatography (HPLC) with 5-fluorouracil (5-FU) as an internal standard for serum uric acid(UA) determination,and to recommend this method as a candidate reference method. To evaluate biases of results of serum uric acid determination by uricase-peroxidase-trinder methods according the revered-phase HPLC result.

Methods

The methodology of the revered-phase HPLC was evaluated. The result accuracy of serum UA by the revered-phase HPLC was verified according to determine a certified reference material (SRM) and the Survey RELA KS (1/06) serum sample of RELA 2006 4th IFCC Ring Trial for Reference Laboratories. The revered-phase HPLC as a comparison method and the uricase methods with closed-system including Beckman, Roche, Dade, Vitros and opened-system including Beckman, Roche as a test methods. 61 samples of serum UA were determined by two methods respectively, which formed six comparison groups. The scatter figures,bias figures,linear equations and correlation coefficients of comparison data in each group were made and the biases of measurement results were evaluated.

Results

The linear range of HPLC was up to 1 190 μmol/L. The intraassay coefficient of variation ( CV) and interassay CV of HPLC were <2.1% and <3.9%,respectively. The absolute recoveries were 96.2%-101.0% and the average relative recoveries were 95.1%-99.4%. The average relative bias was -8.29% for the determination of UA level in SRM by HPLC. Compared with result of isotope dilution mass spectrometry,the relative biases were -3.45% to -1.26% when determined the samples of IFCC by HPLC. There was good correlation between the comparison method(HPLC) and the test method(closed-system including Beckman,Roche,Dade,Vitros and opened-system including Beckman)( R2=0.996 9,0.997 2,0.995 2,0.996 7,0.997 3,0.994 7). When the levels of UA were 120,470,630 μmol/L,the predicted relative bias ranges were -14.6%-4.3%,-0.4%-8.0%,0.8%-8.8%, respectively. There was good consistency between Beckman closed-system and revered-phase HPLC. The results of Roche closed-system in the low value range were lower.The Dade and Vitros closed-system in the high value range were higher. The results of closed-system were slightly better than opened-system.

Conclusions

The revered-phase HPLC with 5-FU as an internal standard is recommended as a candidate reference method for serum UA determination. There were some biases among the results of uricase method in different systems.

Keyword: Uric acid; High perfermance liquid chromatography; Certified reference material; Reference laboratory; Uricase method

血中尿酸(uric acid, UA)含量的升高可作为诊断痛风病、肾功能减退等疾病的主要指标, 其测定方法[1~4]有:同位素稀释质谱(ID-MS)法、高效液相色谱(HPLC)法、化学法、酶法等, 其中ID-MS法为UA测定的一级参考测量方法或决定性方法[1, 2, 5]; HPLC为二级参考测量方法或参考方法[6~8], 临床检测以酶法为主。1993年, 北京大学第一医院建立了以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracli, 5-FU)作内标的反相HPLC测定血清UA的方法[7](以下简称反相HPLC内标法), 我们再次对其进行方法学评价, 进一步测定绝对回收率, 并通过测定有证参考物质(SRM)、参加国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)参考实验室考察活动, 验证此方法的准确性及可靠性, 拟推荐其作为血清UA测定的候选参考方法, 并应用此方法评价酶比色法测定血清UA的结果偏倚, 探讨酶比色法在不同检测系统之间所测UA结果的互通性和一致性。

材料和方法
一、样本来源

1. 混合血清 收集北京大学第一医院住院和门诊患者新鲜血清, 血液样本在2 h内分离血清, 避免溶血、黄疸和脂血, 然后混合成具有高、中、低等各个不同浓度UA的血清样本, 使其分布于整个线性范围内, 每份血清样本留取5 mL, 分装500 μ L/eppendorf管, 密封, -70 ℃冷冻保存, 用时取1份复溶, 避免反复冻溶。

2. SRM SRM 909b LevelⅡ (UA浓度为733 μ mol/L), 美国标准与技术研究所(NIST)产品。

3. IFCC参考实验室考察样本 分A、B 2个浓度水平, Survey RELA KS (1/06) Serum, 冻干品, 5 mL去离子水称重法复溶。

二、仪器

1. 高效液相色谱仪 包括C-R4A数据处理机、SPD-6AV检测器、LC-10AT送液泵、DGU-4A脱气机、CTO-6A柱箱、SIL-1A六通进样阀、R-平衡记录仪, 均为日本岛津公司产品。25 cm× 4.6 mm、5 μ m C18色谱柱(Discovery), 20 μ L微量进样器。

2. 其他 Beckman LX20、Hitachi 7600、Dade RXL、Vitros 250全自动生化分析仪。

三、试剂

1. 洗脱液 1.0 mL异丙醇加800 mL水(蒸馏并去离子), 再加冰醋酸及正丁胺各0.2 mL, 续加水至1 000 mL, 混匀, 用前超声脱气。

2. 含内标5-FU的甲醇液 精取100 μ L 5-FU溶液(192.2 mmol/L, 上海海普药厂)放入100 mL容量瓶内, 续加甲醇至刻度即为含192.2 μ mol/L 5-FU的甲醇液, 用于沉淀血清蛋白质及提取血清中的UA, 4 ℃保存。

3. UA标准储备液 取0.075 g碳酸锂(光谱纯, 天津津科精细化工研究所)用水溶解, 再加入精确称取的0.100 0 g UA(上海天宇进口分装), 溶解后移入100 mL容量瓶内, 续加水至刻度, 即得5.95 mmol/L UA标准储备液, 放棕色磨口瓶密封, 4 ℃保存。

4.含内标5-FU的洗脱液 精取200 μ L 5-FU溶液放入100 mL容量瓶内, 续加洗脱液至刻度即为含384.4 μ mol/L 5-FU的洗脱液, 4 ℃保存, 仅用于绝对回收率中不吹干组的试验。

5. 反相HPLC法其他试剂 均为国产分析纯试剂。

6.酶比色法试剂 Beckman、Roche、Dade、Vitros公司各自与其仪器配套的标准品、质控品、UA测定试剂盒, 中生公司UA测定试剂盒。上述试剂盒检测原理均为酶比色法(UA酶-过氧化物酶偶联Trinder法); Vitros为干化学法。

四、反相HPLC内标法

1.准确吸取系列浓度标准液或血清100 μ L于1 mL eppendorf管中, 再准确加400 μ L含5-FU的甲醇液, 在振荡器上混匀, 于10 000 r/min离心10 min。取上清液200 μ L于另一玻璃试管中, 在液面上方用氮气流吹干, 分析前以洗脱液100 μ L复溶, 漩混1 min。进样10 μ L, 在洗脱液流速0.8 mL/min、波长235 nm、量程为0.02AUFS、柱温20 ℃条件下, 测定计算UA与5-FU的峰高比, 以批内标准曲线计算出样本中UA浓度。

2. 按不同比例用洗脱液稀释UA标准储备液, 配制1 190.0、595.0、396.7、198.4、99.2、49.6 μ mol/L系列浓度UA标准应用液。分别进行HPLC法测定, 以峰高比(H标/H标内)为Y轴, 以对应的UA浓度(C标)为X轴, 制作标准曲线, 获得线性回归方程Y=aX+b, 得C样=1/a× H样/H样内-b/a。式中H标和H标内分别为UA标准应用液中UA和内标5-FU的峰高; H样和H样内分别为样本中UA和内标5-FU的峰高; C标和C样分别为标准品和样本的浓度。

3. 绝对回收试验。(1)不吹干组方法:分别配制标准曲线系列浓度2倍的标准应用液, 准确吸取100 μ L于玻璃试管中, 再准确加400 μ L含5-FU的洗脱液, 混匀, 直接进样10 μ L, 在上述的色谱条件下, 测定UA与5-FU的峰高比; (2)吹干组方法:同标准曲线制备方法。获得各个相同浓度水平不吹干与吹干组相对应的UA与5-FU的峰高比, 则绝对回收率(%)=[H标(吹)/H标内(吹)]/[H标(不吹)/H标内(不吹)]× 100%。

五、常规全自动生化检测

在Beckman、Roche、Dade、Vitros各封闭系统中, 分别使用各仪器配套标准品对其配套试剂进行定标, 测定各仪器配套的室内质控品均在控, 检测血清样本。在Beckman、Roche开放系统中, 仅把其各自的配套试剂改用中生试剂。

六、统计学方法

在酶比色法与反相HPLC内标法的比较中, 以反相HPLC内标法为比较方法(X), 以上述6种检测系统中的酶比色法为实验方法(Y), 对61份血清样本进行双份测定, 分别组成6个比对组, 应用Excel 2000软件, 依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP9-A文件[9]数据处理方法, 对每组比对数据作散点图、偏倚图, 计算线性方程和相关系数(R2), 进行偏倚评估。

结 果
一、反相HPLC内标法的方法学评价

1. 色谱图 在上述色谱条件下, 5-FU与UA的色谱峰见图1, 保留时间分别为7.6 min及8.9 min。

图1 血清提取物色谱图

2. 标准曲线和线性范围 上述方法所获标准曲线在系列标准液浓度范围内。4个分析批次中的峰高(Y)与浓度(X)都呈很好的直线相关关系, 线性方程分别为Y1=0.049X-0.027 3, R2=0.999 5; Y2=0.001 5X-0.067 2, R2=0.999 6; Y3=0.051X-0.014 1, R2=1; Y4=0.005X-0.027 9, R2=1。UA测定的线性范围可达1 190.0 μ mol/L。但各批次间的曲线存在一定的差异。

3. 精密度 分别选取3个接近UA检测医学决定水平浓度附近的血清样本进行批内不精密度测定, 在UA浓度为134、455、659 μ mol/L时, 其批内变异系数(CV)分别为1.94%、1.23%、2.07%; 再选取低、中、高3个水平的血清样本进行日间不精密度测定, 在UA浓度为181、366、562 μ mol/L时, 日间CV分别为3.82%、3.12%、1.85%。

4. 准确度 (1)绝对回收试验:在上述标准曲线6个不同UA浓度测得的绝对回收率为96.2%~101.0%; (2)相对回收试验:于混合血清中加入系列不同浓度的UA, 然后进行反相HPLC测定, 平均相对回收率为95.1%~99.4%。见表1。

表1 反相HPLC内标法测定血清UA的相对回收率(μ mol/L)
二、反相HPLC内标法测定血清UA的准确性验证

1. 检测SRM 每天对SRM平行测定8次, 连测3 d, 日内精密度分别为2.11%、1.72%和1.04%, 日内均有一个超出± 2s的结果。对去除± 2s以外的所有结果进行统计学处理:n=21、 x̅=672.21 μ mol/L、s=7.51 μ mol/L、CV=1.12%。SRM 909b LevelⅡ 靶值为733 μ mol/L, 则反相HPLC内标法测定均值与靶值比较, 其平均相对偏倚为-8.29%。

2. 参加IFCC参考实验室考察活动 参加由IFCC与德国临床化学与检验医学会(DGKL)合作组织的RELA 2006 4th IFCC Ring Trial for Reference Laboratories活动, 每个样本每天平行测定8次, 批内利用2个独立配置的UA标准储备液制备2套标准曲线, 来分别处理样本结果, 连测3 d, 日内均无超出当日± 2s的结果, 对所有结果进行统计学处理。本轮活动参加血清UA项目评审的参考实验室共5家, 其中3家采用ID-MS法, 另外1家为光谱法。对本室反相HPLC内标法结果与另4家结果进行相对偏倚分析见表2。

表2 反相HPLC内标法参加IFCC参考实验室血清UA项目考察的结果
三、应用反相HPLC内标法评价酶比色法测定血清UA的结果偏倚

1. Y̅i对 X̅i作散点图, X̅i、 Y̅i分别为比较方法、实验方法的血清双份测定结果的均值。R2值、线性方程见表3, 利用61份血清样本双份测定的数据, 计算每个比对组中2种方法间的线性回归方程。

表3 酶比色法与反相HPLC内标法比较的线性方程及R2值

2.( Y̅i- X̅i)对 X̅i的偏倚图见图2。

图2 6种检测系统中酶比色法与反相HPLC内标法的偏倚图

3.根据上述线性方程, 对每个比对组中实验方法测得的血清UA结果与比较方法(反相HPLC内标法)的结果进行预期偏倚估计见表4。

表4 酶比色法与反相HPLC内标法测定UA的预期偏倚估计(μ mol/L)
讨 论

本研究应用北京大学第一医院建立的反相HPLC内标法测定血清UA的方法, 再次验证了线性范围、精密度、平均相对回收率, 与先前建立方法时报道[7]的基本一致, 都达到了一定的要求。另外, 实验前按中国计量科学研究院计量要求操作规程, 采用称重法对容量瓶和移液器加以校准, 保证标准液、试剂配置的准确性和加样操作的准确性、一致性。本研究标准曲线采用多点定标, 与先前方法建立时的单点定标相比较, 可减少操作误差。随批制备标准曲线可减少日间柱效变化对检测的干扰; 对于手工仪器, 系列标准品放在样本中间测定, 能起到冲洗分离柱的作用, 减少日内柱效变化对测定的干扰, 提高批内结果的一致性。在标准曲线浓度范围内, 测得反相HPLC内标法的绝对回收率为96.2%~101.0%, 说明在利用甲醇去除血清蛋白质的样本前处理过程中吹气这一环节, 能保证结果的准确性达到要求。实验中还发现, 在液面上小气流悬吹, 可减少吹气对检测的影响。总之, 对于反相HPLC内标法检测UA, 样本前处理过程的第1步即100 μ L血清样本和400 μ L 5-FU甲醇液加样操作的准确对提高实验结果的准确度和精密度最重要, 其次是吹气过程及日内柱效稳定性的影响。有文献[10]报道在HPLC整个分析过程中, 30%的误差源于样本制备, 19%的误差源于实际操作, 本研究结果与其相符。

对反相HPLC内标法的准确性验证, 本研究结果都表现为负偏差。本研究仅测定了UA高浓度水平(733 μ mol/L)的SRM, 表现了较大的相对偏倚(-8.29%); 而参加IFCC参考实验室考察活动时的样本浓度均为正常范围(250~400 μ mol/L), 在与另外3家采用ID-MS法测定UA的实验室的比较中, 与其中2家结果的相对偏倚范围在-1.69%~-1.26%之间, 与另外1家相对偏倚为-3.45%~-3.35%。上述实验所测SRM是高准确度基质标准物质, 其赋值采用的参考程序为NIST血清UA测定的决定性方法:同位素稀释气相质谱法(ID/GC/MS)[1], 标准量值可溯源至国际标准化组织的一级参考测量方法; 在IFCC参考实验室考察活动中, 与反相HPLC内标法进行比对的另外3家参考实验室的结果也由ID-MS法测得, 因此本研究对反相HPLC内标法测定血清UA的结果进行了初步的量值溯源, 其准确度达到了一定的要求, 因此拟初步推荐反相HPLC内标法作为血清UA测定的候选参考方法。分析反相HPLC内标法结果出现负偏差的原因, 可能与UA本身不够稳定、易氧化, HPLC吹气过程引起UA破坏有关; 另外反相HPLC内标法与ID-MS法之间是否存在固有偏差, 有待在条件允许的情况下, 通过2种方法的样本比对实验(按NCCLS EP9-A[9]文件进行)、测定其他参考物质与测量研究所(IRMM)的有证参考物质(BCR)、测定覆盖不同检测浓度范围的SRM(SRM 909b LevelⅠ )等途径, 更全面地探讨和验证反相HPLC内标法的量值转移及互通性。

HPLC[6~8]常需要麻烦费时的样本预处理或使用复杂的柱切换设备, 但作为二级参考测量方法或参考方法, 已在评价UA常规方法和商品试剂盒的工作中应用[8]。目前临床上常规检测以酶比色法最为常用。此法简便, 适于自动化分析, 但易受维生素C、黄疸、溶血、脂血及一些药物的干扰[11~14]。本研究应用反相HPLC内标法为参考方法, 评价常规酶比色法测定血清UA的结果偏倚, 探讨酶比色法在不同检测系统之间所测UA结果的互通性和一致性。Beckman、Roche、Dade、Vitros封闭系统和Beckmen、Roche开放系统酶比色法与反相HPLC内标法的相关分析见表3, 各比对组中R2分别为0.996 9、0.997 2、0.995 2、0.996 7、0.997 3、0.994 7(R2≥ 0.950为合适范围), 说明6种常规检测系统所测UA结果与反相HPLC内标法均相关良好。6种检测系统的酶比色法与反相HPLC内标法的预期偏倚估计见表4、图2。在血清UA医学决定水平即UA为120、470、630 μ mol/L时, 4种封闭系统的预期相对偏倚范围分别为-11.1%~4.3%、-0.2%~8.0%、0.8%~8.8%。本研究结果验证了各封闭系统中酶比色法的检测结果都具有良好的溯源性, 但不同系统之间也存在一些差异, 其中Beckman封闭系统测定结果与反相HPLC内标法的一致性好; Roche封闭系统正常值和高值范围与反相HPLC内标法的一致性较好、低值偏低, UA浓度120 μ mol/L时负偏差已超过10%。Dade和Vitros 2种封闭系统结果比较一致, 与反相HPLC内标法结果相比, 都表现为低值范围一致性好, 但正常值和高值范围有逐渐偏高趋势, 但均未超过10%, 这些差异可能与各厂家标准品的溯源体系不完全一致有关。Beckman开放系统与其封闭系统比较, 低浓度测定值偏低, UA浓度在120 μ mol/L时与反相HPLC内标法的相对偏倚可达-14.6%。Roche开放系统高值范围较其封闭系统偏高, 但低值范围的负偏差比封闭系统小。本研究所用Beckman、Roche开放系统也可满足临床常规检测的需要。从整体观察, 封闭系统比开放系统结果略好一些。另外比对结果也说明开放系统与其对应的封闭系统的测定结果之间存在差异, 所以在实际工作中, 开展开放系统与封闭系统比对工作是十分必要的。血清UA的室间调查变异较小, 这与常规血清UA测定原理相同、各试剂厂家具有良好的溯源性是密不可分的, 这些都为UA检测标准化, 保证检验结果的互通性和一致性提供了良好基础。

检验结果的量值溯源是临床检验标准化的最重要的手段, 国内量值溯源工作处于初始阶段, 本研究初步推荐反相HPLC内标法作为血清UA测定的候选参考方法, 旨在进一步通过参考方法对人血清基质校准品进行定值, 以此来校准常规检测系统, 来进一步探讨是否可以通过此途径能更好地提高UA检测结果的准确性和一致性。

致谢:感谢北京朝阳医院徐静、北京大学第一医院李淑葵、刘静霞给予的支持和帮助!

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Ellerbe P, Cohen A, Welch MJ, et al. Determination of Serum Uric Acid by Isotope Dilution Mass Spectrometry as a New Cand idate Definitive Method[J]. Anal Chem, 1990, 62(20): 2173-2177. [本文引用:3]
[2] National Committee for Clinical Laboratory Stand ards. Development of Definitive Methods for the National Reference System for the Clinical Laboratory; Approved Guideline[S]. Wayne, PA: NRSCL 1-A, NCCLS, 1991. [本文引用:1]
[3] 林小能, 林琳. 尿酸的测定方法及临床意义[J]. 职业卫生与病伤, 2004, 19(4): 280-281. [本文引用:1]
[4] 丁萍, 关鲁雄, 秦旭阳, 等. 尿酸检测方法及进展[J]. 娄底师专学报, 2004, 77(2): 7-9, 12. [本文引用:1]
[5] 陈文祥, 申子瑜, 王抒, 等. 临床检验的量值溯源问题[J]. 中华检验医学杂志, 2003, 26(3): 153-158. [本文引用:1]
[6] Zhiri A, Houot O, Wellman-Bednawska M, et al. Sinmul-taneous Determination of Uric Acid and Creatinine in Plasma by Reversed-phase Liquid Chromatography[J]. Clin Chem, 1985, 31(1): 109-112. [本文引用:2]
[7] 白峰, 徐国宾. 反相高效液相色谱内标法同时测定血清肌酐和尿酸[J]. 中华医学检验杂志, 1993, 16(2): 79-82. [本文引用:2]
[8] 杨树德, 徐家明, 张京城, 等. 反相高效液相色谱法同时测定血清(浆)中的尿酸和肌酐[J]. 中华医学检验杂志, 1989, 12(2): 66-69. [本文引用:3]
[9] National Committee for Clinical Laboratory Stand ards. Method Comparision and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline[S]. EP9-A, NCCLS, 1995. [本文引用:2]
[10] 陈小华. 自动化样品预处理的一项新技术-吉尔森ASTED系统及其应用[J]. 色谱, 1996, 14(5): 369-372. [本文引用:1]
[11] Masson P, Lindahl I. Bilirubin interferes with uric acid determinations involving peroxidase-mediated reac-tions[J]. Clin Chem, 1984, 30(3): 493. [本文引用:1]
[12] 王丹, 涂向东, 胡望平. 用沉淀法消除脂血对尿酸测定的干扰[J]. 上海医学检验杂志, 1999, 14(4): 238-239. [本文引用:1]
[13] 郑淑辉, 赵田, 孙月庭. 血清尿酸浓度测定的影响因素探讨[J]. 华中医学杂志, 2003, 27(1): 22-23. [本文引用:1]
[14] 顾光煜, 王以立, 陈维忠. 临床化学自动分析仪应用指南[M]. 北京: 海洋出版社, 1993: 253. [本文引用:1]