引用本文
陈军浩, 吴超, 刘勇, 张葵. 活化B淋巴细胞诱导健康人外周血HBcAg短肽特异性细胞毒性T淋巴细胞. 2009, 24(7): 518-522
CHEN Junhao, WU Chao, LIU Yong, ZHANG Kui. Induction of HBcAg peptide specific cytolytic T lymphocyte on healthy human peripheral blood monocular cell by activated B lymphocytes. Labratory Medicine, 2009, 24(7): 518-522  
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活化B淋巴细胞诱导健康人外周血HBcAg短肽特异性细胞毒性T淋巴细胞
陈军浩1, 吴超2, 刘勇1, 张葵1
1. 南京大学医学院附属鼓楼医院检验科,江苏 南京 210008
2. 南京大学医学院附属鼓楼医院感染科,江苏 南京 210008

作者简介:陈军浩,男,1966年生,学士,副主任技师,主要从事造血干细胞移植后免疫重建研究。

通讯作者:吴 超,联系电话:025-83304616-10373。

基金:南京市社会发展项目(2005019-5); 南京市医学发展项目(ZKM05043); 南京市医学科技重点项目(K200516)
摘要
目的

探讨负载乙型肝炎病毒核心抗原18-27(HBcAg 18-27)序列肽的活化B淋巴细胞诱导自体外周血单个核细胞(PBMC)产生HBcAg 18-27特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。

方法

免疫磁珠法分选B淋巴细胞,与CpG寡核苷酸(CpG-ODN)(2 μg/mL)和白细胞介素-4(IL-4)(2 ng/mL)共培养48 h,再加入人工合成的HBcAg 18-27肽(50 μg/mL),继续温育12 h。将负载抗原肽的活化B淋巴细胞与自体PBMC进行混合淋巴细胞培养5 d,采用Pro5TM MHC Pentamers技术检测HBcAg 18-27特异性CTL。

结果

免疫磁珠法分选B淋巴细胞纯度为89.60%。荧光显微镜观察到HBcAg 18-27抗原肽进入活化B细胞,流式细胞仪定量检测抗原负载率为41.3%。以此作为HBcAg 18-27特异性抗原递呈细胞(APC)能够从自体PBMC中诱导出HBcAg 18-27特异性CTL。对照组(不加APC)HBcAg 18-27特异性CTL为(0.20±0.10)%,实验组(加APC)为(0.50±0.19)%,2组差异有统计学意义( P<0.01)。

结论

负载了HBcAg 18-27肽的活化B淋巴细胞能够诱导自体PBMC产生HBcAg 18-27特异性CTL。

关键词: CpG寡核苷酸; B淋巴细胞; 乙型肝炎病毒核心抗原; 细胞毒性T淋巴细胞
中图分类号:R446.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)07-0518-05
Induction of HBcAg peptide specific cytolytic T lymphocyte on healthy human peripheral blood monocular cell by activated B lymphocytes
CHEN Junhao1, WU Chao2, LIU Yong1, ZHANG Kui1
1. Department of Clinical Laboratory, Gulou Hospital, Medical College of Nanjing University, Jiangsu Nanjing 210008, China
2. Department of Infectious Disease, Gulou Hospital, Medical College of Nanjing University, Jiangsu Nanjing 210008, China
Abstract
Objective

To activate peripheral blood B lymphocytes by CpG-oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) and load HBcAg 18-27 peptide to make them as antigen presenting cells (APC), then induce hepatitis B virus (HBV)-specific cytolytic T lymphocytes (CTL) from peripheral blood monocular cells (PBMC) of healthy human.

Methods

B lymphocytes were isolated from PBMC with anti-human CD20 immunomagnetic beads. The B cells were cultured in the presence of CpG-ODN and interleukin-4 (IL-4) for 48 h followed by a further incubation for 12 h after adding synthetic HBcAg 18-27 peptide (50 μg/mL). The PBMC were co-cultured with HBcAg 18-27 peptide specific APC for 5 d. The HBcAg 18-27-specific CTL were detected by Pro5TM MHC Pentamers.

Results

According to the results of flow cytometry and fluorescence microscopy, the purity of B cells was 89.60%, and 41.3% of the activated B cells were loaded with HBcAg 18-27 peptide. After co-culture with activated and the peptide-loaded B cells, (0.50±0.19)% of the PBMC were induced to be HBcAg 18-27-specific CTL, while such CTL were only (0.20±0.10)% in the absence of these B cells. The induction of HBcAg 18-27-specific CTL was significant ( P<0.01).

Conclusions

Activated B cells with loaded HBcAg 18-27 peptide may induce HBcAg 18-27-specific CTL on healthy human PBMC.

Keyword: CpG-oligodeoxynucleotide; B lymphocyte; HBcAg; Cytolytic T lymphocyte

慢性乙型肝炎(CHB)是我国最常见的传染性疾病之一, 临床研究证实CHB患者有乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的缺陷[1, 2]。目前认为, 体内清除HBV主要机制是由CTL介导的HBV感染的肝细胞溶解和/或CTL产生细胞因子, 如γ 干扰素等的抗病毒效应。因而多克隆、多特异性、应答能力强的HBV特异性CTL在CHB的转归中尤为重要。以树突状细胞(DC)为基础的诱导HBV特异性CTL治疗方法在临床中取得了一些进展, 有效率达52.9%[3], 但DC疫苗制备复杂且成本高昂。本研究以CpG寡核苷酸(CpG-ODN)活化人类B淋巴细胞, 并通过负载HBV核心抗原18-27(HBcAg 18-27)序列肽, 得到具有特异性抗原递呈功能的抗原递呈细胞(APC), 再与自体淋巴细胞混合培养, 期望诱导出HBcAg 18-27特异性CTL, 以达到清除CHB患者体内HBV的目的。

材料和方法
一、研究对象

新鲜献血员人类白细胞抗原A2(HLA-A2+)外周血白膜层细胞, 由南京市血液中心和江苏省血液中心提供。

二、仪器和试剂

1. 主要仪器 FACS Calibur流式细胞仪为美国Becton-Dickinson公司产品; 荧光显微镜为德国Zeizz公司AXIO imager.A1; Thermo Forma CO2培养箱; MiniMACS细胞分选仪。

2. 主要试剂 抗人CD20微珠(anti-human CD20 MicroBeads)购自美天旎生物技术有限公司; CpG-ODN 2216由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 全硫代修饰, 序列为5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3'; 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的和非荧光素标记的HBcAg18-27序列肽(FLPSDFFPSV)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; IMDM、RPMI1640、胎牛血清、白细胞介素-4(IL-4)均为Gibco公司产品; Pro5TM MHC Pentamers Kit为英国Proimmune公司产品, 含有FITC标记的CD8、藻红蛋白(PE)标记的HLA-A* 0201, 装配多肽为HBcAg18-27抗原肽, 序列为FLPSDFFPSV。

三、方法

1. 磁珠分选B淋巴细胞 将密度梯度离心法获得的健康人外周血单个核细胞(PBMC)用IMDM细胞培养液洗涤1次, 以1 500 r/min(离心半径为12 cm)离心5 min。加入CD20单抗的磁珠(Miltenyi), 4 ℃放置20 min, 用MiniMACS细胞分选仪阳性选择其中B淋巴细胞, 其余的细胞保留备用。使用四色流式细胞术CD3-FITC/CD19-别藻蓝蛋白APC/ CD56+CD16-PE/CD45-叶绿素荧光蛋白(PreCP)检测分选前后B淋巴细胞的百分含量。

2. 活化B淋巴细胞及负载HBcAg18-27抗原肽 以IMDM培养液调整B淋巴细胞为2.5× 105细胞/mL, 置6孔细胞培养板中(4 mL/孔), 分别加入IL-4(2 ng/mL)、CpG-ODN(2 μ g/mL), 37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h, 使B淋巴细胞活化。分别加入FITC标记的或非荧光素标记的HBcAg18-27抗原肽(50 μ g/mL)培养12 h后收集细胞, 用PE标记的CD19标记B细胞, 以RPMI1640细胞培养液洗涤2次, 以1 500 r/min(离心半径为12 cm)离心5 min, 荧光显微镜观察和流式细胞仪检测抗原负载状况, 非荧光标记HBcAg18-27抗原肽的一组作为抗原特异性APC, 用于下述混合淋巴细胞培养, 诱导PBMC产生HBcAg18-27抗原特异性CTL。

3. HBcAg18-27抗原特异性CTL的诱导 将上述负载HBcAg18-27抗原的活化B淋巴细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液洗涤2次, 以1 500 r/min(离心半径为12 cm)离心5 min, 加入到先前CD20阳性选择后余下的淋巴细胞中(6孔培养板, 1× 106/孔), 每份标本均做对照, 对照组加入无负载抗原的活化B细胞。2组在IL-2(300 U/mL)存在的情况下, 37 ℃ 5% CO2培养箱中培养5 d, 收集细胞, 以Pro5TM MHC Pentamers技术检测其中HBcAg18-27抗原特异性CTL的含量。

四、统计学方法

使用SPSS 12.0统计软件进行分析, 数据以 x̅± s表示, 实验组与对照组之间的比较采用t检验; P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、磁珠分选前和分选后B淋巴细胞的百分含量检测。

在CD45-侧向角(SSC)点图上设“ 门” 于淋巴细胞区域, 进而分析各亚群细胞的含量。分选前标本以T淋巴细胞(CD3+)为主, 少量的自然杀伤(NK)细胞(CD3-CD56+CD16+), B淋巴细胞(CD19+)含量为7.89%。分选后得到的主要是B淋巴细胞, 含量为89.60%, 也伴有少量的T细胞和NK细胞, 见图1。从30 mL外周血中通常可得到1× 106个B淋巴细胞。

图1 流式细胞仪检测磁珠分选前后B淋巴细胞的百分率

二、CpG-ODN 2216能够活化B淋巴细胞, 使其高表达抗原递呈相关分子及共刺激分子

本实验在活化的B淋巴细胞中加入了FITC(绿色荧光)标记的HBcAg18-27抗原肽进行抗原负载, 然后用CD19-PE(红色荧光)标记B淋巴细胞, 结果HBcAg18-27抗原肽负载成功, 主要位于细胞浆内, B淋巴细胞抗原负载率为41.3%, 见图2。

图2 流式细胞仪检测B细胞抗原负载状况

三、取5份HLA-A2阳性献血员PBMC, 分别

进行B淋巴细胞的磁珠分选、CpG-ODN活化。活化的B淋巴细胞负载未标记荧光素的HBcAg18-27序列肽, 作为抗原特异性APC, 与自体PBMC作混合淋巴细胞培养, 诱导HBcAg18-27抗原特异性CTL。培养5 d后收集细胞, 以Pro5TM MHC Pentamers技术检测诱导出的HBcAg18-27抗原特异性CTL含量。结果显示, 实验组HBcAg18-27抗原特异性CTL为(0.50± 0.19)%, 对照组为(0.20± 0.10)%, 2组差异有统计学意义(P< 0.01), 证明活化的B淋巴细胞负载HBcAg18-27抗原肽能够激发PBMC产生HBcAg18-27抗原特异性CTL, 见图3。

图3 Pro5TM MHC Pentamers检测HBcAg18-27抗原特异性CTL(Q2-1区)

讨 论

成人CHB免疫耐受的机制尚不清楚, 但与最终能够完全清除HBV而康复的急性乙型肝炎患者相比, CHB的特点是针对病毒反应的CD4+和CD8+T细胞显著减少[1], 特别是HBV特异性CTL减少[2], 导致机体不能彻底清除残留的HBV。机体产生的针对HBV特异性CTL, 其数量和功能与乙型肝炎患者的转归、抗病毒疗效及HBV载量的控制密切相关[4]。主要机制为:HBV感染肝细胞之后, 其抗原成分与肝细胞内HLA-Ⅰ 类分子结合成复合物, 并表达于肝细胞表面, 成为HBV特异性CTL的识别表位, 因而发挥特异性清除肝细胞内HBV的作用[4]。临床研究表明, 血清HBV DNA水平高的患者, 肝脏内HBV特异性CTL水平较低; 相反, 血清HBV DNA水平低的患者, 肝脏内HBV特异性CTL水平较高[5], 此结果提示我们, 增加体内HBV特异性CTL的数量, 可控制机体HBV载量。因此, 提高机体HBV特异性CTL的数量和功能对于CHB的治疗及减少并发症有重要的意义。

既往的研究证实, HBV特异性CTL增加并不加强肝脏的炎症反应, HBV特异性CTL含量的高低与肝脏炎症程度并不相关[5]。虽然在急性肝炎发生时, 肝脏内HBV特异性CTL的百分比与肝脏损伤程度有一定的联系, 这主要是HBV特异性CTL迁移至肝脏内的缘故, 但在HBV e抗原(HBeAg)转阴3个月后, 肝脏内依然保持较高水平的HBV特异性CTL[6], 提示HBV特异性CTL并不是导致肝脏细胞大量损伤的直接原因, HBV患者肝脏细胞损伤主要是由于大量浸润的非HBV特异性淋巴细胞产生炎性细胞因子及免疫复合物沉积于肝细胞表面所致[7]。更有资料显示, 在低HBV DNA载量且无肝损伤组中发现了高水平的HBV特异性CTL, 而在高水平HBV DNA载量且伴有肝损伤炎症组中, 肝组织内HBV特异性CTL绝对数量与前组相似, 同时观察到大量非特异性淋巴细胞浸润, 提示HBV特异性CTL清除体内HBV也可能不依赖肝细胞的损伤而进行[8]。这些实验结果提示我们, 用不同的方法诱导出HBV特异性CTL, 是清除CHB患者体内残留HBV的有效方法。

目前CHB治疗性合成疫苗多以HBcAg 18-27序列肽诱导CTL产生, 激发以细胞免疫为主的抗病毒免疫效应[9]。B淋巴细胞除了能够分泌抗体之外, 还具有抗原递呈的功能。特别是经CpG-ODN 2216活化之后, 其表面抗原递呈相关分子CD80、CD86、HLA-Ⅰ 、HLA-Ⅱ 类分子大幅度提高[10]。在CpG和CD40L的共同作用下, 活化的B细胞甚至能够激活naive T细胞[11]。从这个方面来说, B细胞的抗原递呈功能几乎与DC相当。由于体内B细胞来源和数量远大于DC, 因此用活化的B细胞打破CHB患者对HBV免疫耐受, 可能有益于CHB患者自身彻底清除体内的HBV。由此, 本研究探讨了负载抗原的活化B细胞能否从PBMC中诱导出特异性CTL的产生, 以替代制作复杂、成本昂贵的DC疫苗。

本研究用免疫磁珠法分离了外周血中B淋巴细胞, 最高纯度达到89.60%, 符合一般文献报道。通过CpG-ODN 2216活化B淋巴细胞, 并负载HBcAg 18-27序列肽, 荧光显微镜观察到标记了FITC的HBcAg序列肽位于细胞浆内, 用流式细胞仪检测了抗原负载效率为41.3%, 从而判断抗原负载成功。利用负载了抗原的活化B细胞具有抗原递呈细胞的性质, 我们从PBMC中成功诱导出HBcAg 18-27抗原特异性CTL, 五聚体实验技术检测诱导后PBMC中HBcAg 18-27抗原特异性CTL的结果显示, 加入负载了HBcAg 18-27抗原肽的活化B细胞组产生特异性CTL的数量较对照组高1.5倍。

HBV特异性CTL是CHB患者清除体内残留HBV的主要功能性细胞, 如何将其激发出来并参与机体彻底清除HBV是目前研究的热点。尽管DC疫苗已经显示了初步疗效[3], 但其制备过程的复杂性、费用昂贵使得其临床应用受到了限制。本研究显示用CpG-ODN 2216活化的B细胞同样可诱导出HBV特异性CTL, 有可能成为治疗CHB的新型疫苗。

The authors have declared that no competing interests exist.

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