引用本文
刘忠民, 张婷, 冯健明, 郑贵星. C-肽时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制. 2009, 24(7): 514-517
LIU Zhongmin, ZHANG Ting, FENG Jianming, ZHENG Guixing. Development of a time-resolved fluoroimmunoassay kit for detecting C-peptide. Labratory Medicine, 2009, 24(7): 514-517  
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C-肽时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制
刘忠民1, 张婷1, 冯健明2, 郑贵星1
1. 广州医学院医学检验系,广东 广州 510260
2. 广州丰华生物工程有限公司,广东 广州 510730

作者简介:刘忠民,男,1962年生,硕士,主任技师,主要从事临床实验诊断的医疗、教学和科研工作。

基金:广州市科技攻关项目(2005Z3-E0591)
摘要
目的

研制血清C-肽的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)试剂盒。

方法

采用双抗体夹心法建立C-肽TRFIA试剂盒,并进行方法学评价。

结果

C-肽可测量范围为0.4~20 ng/mL;分析敏感性为0.23 ng/mL;分析批内、批间精密度分别为7.99%、11.97%;C-肽回收率为99.57%;与胰岛素和胰岛素原无交叉反应。稳定性试验表明,试剂可以贮存在4 ℃稳定9个月,37 ℃稳定7 d;该试剂盒测试200份正常人血清样本,其参考范围为0.358~3.590 ng/mL;收集122份血清样本,用该试剂盒与国外其他方法的同类试剂盒同时检测,其相关系数为0.943 2,线性方程为 Y=0.985 4 X+0.506 3。

结论

C-肽TRFIA试剂盒各项指标均达到临床检测要求,适合临床推广使用。

关键词: 时间分辨荧光免疫分析; C-肽; 方法学评价
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)07-0514-04
Development of a time-resolved fluoroimmunoassay kit for detecting C-peptide
LIU Zhongmin1, ZHANG Ting1, FENG Jianming2, ZHENG Guixing1
1. Department of Laboratory,Guangzhou Medical College,Guangdong Guangzhou 510260, China
2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Company Limited, Guangdong Guangzhou 510730,China
Abstract
Objective

To develop a time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA) kit for detection of C-peptide in serum.

Methods

Two anti-C-peptide monoclonal antibodies were used to develop the sandwich TRFIA kit for detection of C-peptide in serum and its methodology was evaluated.

Results

The detection range of C-peptide was 0.4-20 ng/mL.The analytical sensitivity was 0.23 ng/mL. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were 7.99% and 11.97% respectively. The recovery rate was 99.57%. There was no cross-reactivity with insulin and proinsulin. The TRFIA C-peptide reagents could be stored at 4 ℃ for 9 months and at 37 ℃ for 7 days. The reference value for TRFIA C-peptide kit in healthy subjects(200 cases) was 0.358-3.590 ng/mL. The correlation coefficient of blood samples detection results(122 cases) between this TRFIA kit and commercially available electrochemiluminescense immunoassay C-peptide kits was 0.943 2. The linear equation was Y=0.985 4 X+0.506 3.

Conclusions

The developed TRFIA C-peptide kit is valuable for clinical application with good sensitivity, precision, accuracy, specificity and stability.

Keyword: Time-resolved fluoroimmunoassay; C-peptide; Methodology evaluation

糖尿病是一组由胰岛素分泌绝对或相对不足所导致的以慢性高血糖为特征的代谢综合征。血清胰岛素和C-肽水平对糖尿病的分型诊断、治疗方案选择和疗效监测都具有重要的临床价值, 是糖尿病患者主要的常规检测项目[1]。目前, 检测人血清C-肽的方法有多种, 由于技术的先进性、实用性, 时间分辨荧光免疫分析(time resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)在国外已被广泛应用于临床检测领域[2]。为促进该试剂盒的国产化, 我们对血清C-肽TRFIA检测试剂盒进行了研制。

材料和方法
一、材料与仪器

1. 试剂 C-肽抗原及抗C-肽单克隆抗体均购自美国Biodesign公司; 96孔微孔板为Labsystem公司产品; 三价铕离子(Eu3+)标记试剂盒购自PerKin Elmer公司, 自制以β -萘甲酰三氟丙酮为主要化合物的Eu3+发光增强剂; 交联葡聚糖G-50(Sephadex G-50)为Pharmacia产品; C-肽标准品为PerKin Elmer公司产品; C-肽质控血清为中国药品生物制品检定所产品; 其他试剂均为国产分析纯。

2. 样本 200份健康人血清样本来自广州医学院第一附属医院体检者, 经临床诊断无糖尿病、内分泌疾病。60份异常血清样本来自广州医学院第一附属医院内分泌科住院和门诊糖尿病患者, 全部样本经E-170全自动电化学发光免疫分析仪检测, C-肽浓度均高于参考范围上限。体检者和患者于清晨空腹采血, 常规分离血清, -80 ℃冰冻保存, 15 d内测定, 操作严格按说明书进行。

3. 仪器 Auto DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪为芬兰Wallac公司产品; E-170全自动电化学发光免疫分析仪为瑞士罗氏公司产品, 试剂由罗氏公司提供。

二、试剂盒组分制备方法

1. 固相包被板的制备 将包被抗体(抗C-肽McAb)用50 mmol/L、pH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5 mg/L, 向96孔微孔板各孔中加入200 μ L, 4 ℃过夜, 弃除包被液, 冲洗3次, 加入280 μ L含2%牛血清白蛋白的上述缓冲液封闭, 4 ℃过夜, 弃除封闭液, 真空抽干, 板条密封后置-20 ℃保存。

2. Eu3+标记抗体的制备 参照Eu3+标记盒说明书操作。将0.5 mg标记抗体加入Millipore公司带有滤膜的离心管中, 6 000 r/min(离心半径为8 cm)离心5~6 min; 再用50 mmol/L、pH值9.3的碳酸盐标记缓冲液重复洗涤6次。将200 μ L标记抗体和0.5 mg Eu3+标记试剂混匀后, 4 ℃过夜。标记完成后上Sephadex G-50层析柱(1 cm× 30 cm)分离纯化, 用含0.155 mol/L NaCl的50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)洗脱液洗脱, 收集流出液(1 mL/管), 用280 nm波长监测收集蛋白峰; 合并峰管并确定蛋白量, 以PerKin Elmer公司Eu3+标记试剂盒中的Eu3+标准测定合并峰管的Eu3+浓度。所得标记率为9.45, 蛋白回收率为85%。

三、C-肽的测定方法

微孔板上依次加入25 μ L C-肽标准品或待测血清, 再加入200 μ L反应缓冲液, 25 ℃缓慢振荡孵育2 h。洗涤2次后加入以反应缓冲液1∶ 75倍稀释的Eu3+标抗体200 μ L/孔, 再振荡孵育1 h。洗涤6次, 加入增强液200 μ L/孔, 振荡5 min后检测荧光强度。全部过程均在Auto DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪上完成。数据处理采用全自动检测仪上的Log-Logit函数处理。

四、试剂盒的性能指标考核方法

1. 标准曲线 以Auto DELFIA 1235自带的绘图软件绘制标准曲线。用PerKin Elmer公司C-肽TRFIA试剂盒的5个标准品对仪器进行标定, 用Log-Logit函数数据处理程序绘制标准曲线。C-肽浓度(A~E点)分别为0、0.8、4.4、18.7和28 ng/mL。

2. 线性范围 将标准品抗原稀释成不同浓度进行测定。C-肽浓度为100 ng/mL (批号150553-9911)。

3. 分析敏感性(最低检测量) 以零标准品(A点)当作样本重复测定20次, 计算其荧光均值s及标准差( x̅)。以A点荧光值的 x̅+2s所得的荧光值代入标准曲线方程, 计算所得出的浓度为其最低检测量。

4. 精密度 采用两步法对中国药品生物制品检定所提供的3种浓度的质控血清进行测定, 每个浓度设8个复孔, 重复检测3 d, 分别计算各质控血清检测值的批内和批间 x̅、s及变异系数(CV); C-肽浓度为2.0、6.5和12.0 ng/mL。

5. 准确度 向C-肽浓度正常的血清样本中分别加入低、中、高浓度的标准品, 各制成3个待测样本, 进行回收试验。

6. 特异性(交叉反应) 用C-肽试剂盒检测胰岛素(289 μ U/mL)和胰岛素原(10 ng/mL), 测得的表观C-肽浓度应< 0.4 ng/mL。采用两步法进行测定。

7. 稳定性 将3批试剂分别放置于4 ℃ 6个月和9个月, 以及37 ℃放置7 d后, 比较放置前后标准品各点荧光值间的线性关系以及零标准品荧光值。

8. 参考值范围 用试剂盒检测200份健康体检者血清, 统计检测C-肽浓度值的分布情况, 数据以 x̅± 2s表示。

9. 与电化学发光免疫分析(electrochemiluminescense immunoassay, ECLIA)比较 用TRFIA诊断试剂盒和ECLIA试剂盒同时检测血清样本122例, 计算两者测定C-肽的相关系数(r), 分析2种试剂盒的相关性。

结 果
一、标准曲线

经Log-Logit函数数据处理程序处理所得的C-肽TRFIA试剂盒标准曲线见图1。拟合的标准曲线公式为LogY= a+bLogX。

图1 C-肽试剂盒标准曲线

二、标准曲线工作范围

由图1可见, 当C-肽浓度为0.4~20 ng/mL时, 试剂盒的标准曲线具有良好的线性关系。当浓度> 50 ng/mL时, 钩状效应(Hook)开始出现, 见图2。

图2 C-肽试剂盒的Hook效应曲线

三、分析敏感性(最低检测量)

以零标准品荧光值的 x̅+2s所得的荧光值代入标准曲线方程, 计算所得的C-肽浓度为0.23 ng/mL。

四、精密度

经重复检测低、中、高3种浓度的质控血清, 其批内CV值分别为11.90%、8.10%和3.97%, 平均CV值为7.99%; 其批间CV值分别为8.40%、13.50%和14.70%, 其平均CV值为11.97%。以试剂盒批内和批间CV值均< 15%为判断依据, 符合试剂盒检定要求。

五、准确度

用回收试验测试系统的准确度, 回收率为99.57%, 与有关报道[3]相符, 提示系统测试准确度较高, 能满足临床要求。

六、特异性

用C-肽试剂盒检测胰岛素(289 μ U/mL)和胰岛素原(10 ng/mL), 结果分别为0.41 μ U /mL和0.19 ng/mL, 符合判定标准的要求, C-肽试剂盒无交叉反应。

七、稳定性

3批试剂分别放置于4 ℃ 6个月和9个月, 以及37 ℃ 7 d后, 参考标准品各点荧光值未见明显降低, 且本底荧光值无明显升高, 表明试剂盒标准曲线无明显漂移, 满足稳定性要求。

八、参考范围

200份体检者血清C-肽测定结果为(2.72± 1.43)ng/mL, 检测最低值、最高值分别为0.48、13.57 ng/mL, 多数样本的C-肽浓度值在4 ng/mL以下 (88%), 见表1。综合本研究、其他人的研究[4]及临床现行参考范围值, 我们认为使用该试剂盒进行检测, C-肽血清参考值范围为0.358~3.590 ng/mL是可行的。但各医院使用时应根据各地区样本的差异, 建议设立自己的参考范围。

表1 正常人C-肽检测结果统计表(200例)
九、与ECLIA比较

对122例样本同时进行TRFIA试剂盒和ECLIA试剂盒检测, 线性方程为Y=0.985 4X+0.506 3, 其r=0.943 2, 见图3 。

图3 C-肽TRFIA试剂盒与ECLIA 试剂盒测试相关回归分析

讨 论

胰岛素和C-肽均由胰岛β 细胞分泌, 由胰岛素原等摩尔分裂而成。C-肽相对分子质量为3 600, 无生物活性, 其对保证胰岛素的正常结构是必须的。血清中胰岛素和C-肽的检测对指导胰岛素治疗、鉴别各种低血糖原因、糖尿病的分型、判断胰岛瘤手术效果等具有重要意义[5, 6]。目前, 国内外检测血清C-肽的方法均为标记免疫分析法。在这些方法中, 同位素标记存在放射性污染、半衰期短等缺点; 而TRFIA 采用非放射性原子标记技术, 标记位点多, 对标记物的影响小, 可极大地提高方法学的敏感性; 激发光和发射光谱的Stock 位移大, 可提高方法的稳定性; 相对长的荧光发射周期, 可有效的减少非特异性干扰。采用TRFIA 建立的试剂盒具有有效期长、无放射

性污染、敏感性高、标准曲线量程宽、可全自动及应用范围广泛等优点[7, 8], 是目前和将来替代酶免、放免等方法的最有发展前途的检测手段之一。

对试剂盒方法学性能指标的检测结果显示, TRFIA系统最小检测量接近国外同类产品水平, 批内、批间CV值均< 15%, 显示该系统的精密度较高; 稳定性试验表明试剂在4 ℃可保存9个月, 标准曲线无明显漂移; TRFIA和ECLIA经临床同步比较, 结果相关性良好。因此, 本研究研制的TRFIA C-肽试剂盒各项指标均达到临床检测要求, 值得临床推广应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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