引用本文
浑守永. 山东汉族RhD阴性个体基因多态性研究. 2009, 24(7): 493-496
HUN Shouyong.. Study of RhD gene polymorphism among RhD-negative Han population in Shandong province. Labratory Medicine, 2009, 24(7): 493-496  
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山东汉族RhD阴性个体基因多态性研究
浑守永
山东大学附属省立医院输血科,山东 济南 250021

作者简介:浑守永,男,1970年生,硕士,主管技师,主要从事临床输血研究。

摘要
目的

研究山东汉族人群RhD阴性个体RhD基因多态性。

方法

采用标准血清学方法和抗球蛋白实验筛选Rh阴性个体;对Rh阴性个体再用吸收放散实验确定DEL型。运用多重聚合酶链反应(PCR)方法分析RhD阴性个体基因存在情况。

结果

67例Rh阴性个体中DEL型16例,占Rh阴性个体的23.88%,其6个RhD基因特异性的第3、4、5、6、7、9外显子全部存在;剩下51例Rh阴性个体中1例缺失第5外显子,其余50例6个外显子全部缺失。

结论

山东汉族人群RhD阴性个体中存在一定比例的DEL型,且所有DEL样本均具有完整的RhD基因,在排除DEL型后的RhD阴性个体可能携带RhD基因,但其比例较低。

关键词: Rh血型系统; RhD基因; 多态性; 聚合酶链反应; 多重
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)07-0493-04
Study of RhD gene polymorphism among RhD-negative Han population in Shandong province
HUN Shouyong.
Department of Transfusion, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Shandong Jinan 250021, China
Abstract
Objective

To study the RhD gene polymorphism among RhD-negative Han population in Shandong province.

Methods

The RhD-negative individuals were screened by the standard serological method and antiglobulin test; The DEL individuals were identified by absorption/elution method. RhD gene polymorphisms in RhD-negative individuals were analyzed by multiplex polymerase chain reaction (PCR).

Results

16 of 17 individuals were identified as DEL and the percentage of DEL was 23.88%.All DEL individuals had all the six RhD-specific exons (Exon 3, 4, 5, 6, 7 and 9). The RhD-negative individuals showed two polymorphisms: 1 of 51 individuals lacked the fifth exon and the others of them lacked all the six RhD-specific exons.

Conclusions

DEL phenotype is highly detected among RhD-negative Han population in Shandong province. DEL individuals have intact RhD gene .The RhD-negative individuals excluding DEL phenotyping may carry RhD gene. However, the carrying proportion is low.

Keyword: Rh blood group system; RhD gene; Polymorphism; Polymerase chain reaction; multiplex

Rh血型系统是继ABO血型系统之后临床意义最大的血型系统, 尤其是D抗原, 它是除ABO血型系统外最强的红细胞抗原, 具有极强的免疫原性, 有国外文献报道RhD阴性个体输入1单位RhD阳性血液后, 产生同种抗体的概率是80%[1], 可引起严重的新生儿溶血病和溶血性输血反应, 甚至死亡。因此人们对Rh血型的研究倍加重视, 近年来也取得了很大进展。

RhD基因被克隆后早期观察发现, RhD阳性个体携带RhD基因, RhD阴性个体缺少RhD基因[2~4], 因此人们试图通过检测是否存在D基因来鉴定Rh血型, 然而随着研究的深入, 研究者分别在加拿大人[5]、黑人[6]、和日本人[7]中发现了RhD阴性个体存在D基因现象, 且不同种族Rh阴性个体D基因存在情况不同, 提示RhD基因多态性有不同的种族遗传背景。国内有学者曾对中国汉族人群RhD阴性基因多态性进行过分析, 显示RhD基因具有3种多态性:具有完整的RhD基因、带有部分RhD基因、RhD基因完全缺失。尤其是RhD阴性个体携带完整RhD基因的比例较高(30%), 然而大部分这些研究均未把DEL型排除在外[8] 。本研究对筛选为RhD阴性的67例标本再进行DEL型鉴定, 并运用多重聚合酶链反应(PCR)技术检测具有RhD基因特异性的6个外显子对其进行基因多态性研究, 以期发现其多态性规律。

材料和方法
一、研究对象

所研究的Rh阴性标本来自无偿献血供血者中筛选得到的标本以及在部分住院的患者中筛选得到的标本, 均为汉族, 无亲缘关系, 共67例。

二、方法

1. Rh阴性初筛及DEL确定 用1种IgG+IgM混合抗D标准血清对标本进行RhD抗原鉴定, 对初筛为Rh阴性的标本采用间接抗球蛋白实验, 至少用3批以上抗D血清进行Rh阴性确认。间接抗球蛋白试验(IAT)阴性样本参照文献[9]用三氯甲烷/三氯乙烯作吸收放散试验, 以确定是否为DEL型。

2. 基因组DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血, 用美国G& T公司基因组DNA抽提试剂盒分离获得, -20℃保存待用。

3. 多重PCR检测RhD基因外显子 多重PCR引物的合成采用Maaskant-van Wijk设计的独特的多重PCR体系[10], 这些引物在3'端具有RhD特异性, 其中有6条引物在近3'端引入错配碱基以避免在扩增期间的RhCE基因干扰, 引物序列、位置以及扩增基因片段长度见表1, 以人β -肌动蛋白基因序列特异性引物做对照, 其序列为S:5'-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3', AS:5'-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3', 产物长度200bp, 上述引物均由上海英骏公司合成与纯化, 所有引物浓度均调整为10pM, 反应体系为0.5 μ L R364、R474、BACTF、BACTR, 1.0 uL R496、R621、R898M、REX6AD3、R973、R1068, 2.0 μ L R648、REX5AD2、REX9SD2、R1219M, 10× Ex Taq Buffer (Mg2+plus) 5 μ L, dNTPs 4 μ L, Ex Taq hS 0.4 μ L, 去离子水22.6 μ L, 模板DNA 2 μ L; 循环参数为95 ℃预变性10 min; 95℃变性1 min, 54 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 35个循环, 72 ℃延伸10 min, 降温至4 ℃, 至此完成PCR扩增。PCR扩增产物用12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳进行分离, 溴化乙锭染色15 min, 进行图象分析。

表1 RhD基因引物的序列与位置
结 果
一、DEL确认

经抗球蛋白试验确定为阴性后的67例样本用吸收放散试验作RhDel分析, 其中的16例(22.38%)为RhDel型。

二、RhD基因多态性

使用多重PCR技术结果显示, 在67例标本中, 16例标本检测到所有6个RhD基因特异性的外显子3、4、5、6、7、9占23.88%, 均为DEL型; 51例真阴性标本有1例未检测到RhD第5外显子, 检测到RhD第3、4、6、7、9外显子, 其余50例6个外显子均缺失, 占98.04%(不同检测结果如图1所示)。

图1 多重PCR基因扩增电泳图谱

讨 论

Rh血型系统作为继ABO血型系统之后临床意义最大的血型系统, 成为近年来研究的热点, 尤其是D抗原, 它是除ABO血型系统外最强的红细胞抗原, 由于其具有极强的免疫原性, 极易产生同种抗体引起严重的新生儿溶血病和溶血性输血反应, 甚至死亡。因此人们对RhD血型的研究显得至关重要。

自Rh血型系统的双基因结构阐明以后, 最早对高加索人种的研究表明, RhD(-)个体不存在RhD基因, RhD(+)个体存在RhD基因[2~4]。因此, 欧美国家已将RhD基因定型技术应用于临床[11], 即根据是否能扩增出RhD基因而加以判断。然而, 最新研究表明, RhD基因结构存在种族差异, 部分非洲黑人和东方人群(日本人)RhD(-)个体存在或部分存在RhD基因[6、7、12、13], 尤其在日本人中这种现象较多。我国科学工作者对Rh阴性基因研究表明, 中国汉族人群Rh阴性基因具有3种多态性, 即具有完整的RhD基因结构、具有部分RhD基因结构、RhD基因结构完全缺失, 尤其是具有完整RhD基因结构的比例较大, 占20~30%[8, 14], 与日本人相似, 然而最近有研究表明在以往所研究的RhD阴性个体中经吸收放散实验证实有相当部分红细胞带有RhD抗原, 不是真正的RhD阴性, 称为DEL型[15]。国外报道, 即使排除DEL型, 一些RhD阴性个体[5~7]仍能检出RhD基因, 而DEL型则保留有完整的RhD基因[16]。本研究对67例标本用多重PCR分析其基因构成, 17例检测到RhD基因(25.37%), 与国内报道相似。但在排除16例Del型后, 仅有1例RhD阴性个体检测到RhD基因, 占全部RhD阴性的1.96%, 有报道[17]在155名被确认的RhD阴性台湾地区中国人中检出10名个体存在RhD基因片段, 占6.5%; 在排除DEL型后, Singleton[18]检测82名被确认的RhD阴性非洲黑人, 发现仅18%的个体完全缺失D基因; Okuda[7]则报道130名被确认的RhD阴性日本人中, 29.2%能检出RhD基因, 与我们的研究有一定差异。Sun[17]报道台湾地区中国人DEL型占32%, 本研究发现在67例标本中DEL型占23.88%, 与文献报道有一定差异, 我们和其他作者[16, 17]均发现DEL 100%携带RhD基因, 因而研究RhD阴性个体携带RhD基因, 必须排除DEL型。值得一提的是本研究在排除DEL型后观察到仅2种多态性, 与文献报道有一定差异[16], 尤其是并未发现Rh真阴性个体携带完整RhD基因。对于与文献报道结果的差异, 可能由于研究标本量的数量不够所致。另外由于我们采用的多重PCR体系仅对RhD基因10个外显子中具有RhD基因特异性的6个外显子进行了检测, 而此多重PCR体系并不能检测所有的D变异体, 由此也可能对分析结果造成一定误差, 但是根据文献由此造成的误差应该是很小的。因此对于我们的研究结果应进一步关注。

由于本研究只是运用多重PCR技术对RhD阴性标本进行基因多态性分析, 而对检测到的外显子未作进一步的测序分析, 本研究中未检出第5外显子的标本, 可能是RhD基因的第5外显子缺失, 或者第5外显子被RhCE基因相应区取代, 也可能是第5外显子及两侧区域发生基因突变所致, 需要进一步研究。

尽管近年来对RhD血型的研究取得了很大进展, 但是随着研究技术的不断提高以及研究的不断深入, 我们相信在RhD血型的研究方面会取得更大突破。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] PL Mollison, CP Engelfriet, M Contreras, et al. Blood ransfusion in clinical medicine[M]. 9thed. Oxford: Black-well Scientific Publications, 1993: 225. [本文引用:1]
[2] Simsek S, Fass Bh, Bleeker PM, et al. Rapid RhD genotyping by polymerase chain reaction based amplification of DNA[J]. Blood, 1995, 85(10): 2975-2980. [本文引用:2]
[3] Rouillac C, Gane P, Cartron J, et al. Molecular basis of the altered antigenic expression of RhD in weak D(Du) and RhC/e in Rh phenotypes[J]. Blood, 1996, 87(11): 4853-4861. [本文引用:1]
[4] Wagner FF, Gassner C, Muller Th, et al. Molecular basis of weak D phenotypes[J]. Blood, 1999, 93(1): 385-393. [本文引用:2]
[5] Avent ND, Martin PG, Armstrong-Fisher SS, et al. Evidence of genetic diversity underlying RhD-, weakD(Du) and partial D phenotypes as determined by multiplex polymerase chain reaction analysis of the RhD gene[J]. Blood, 1997, 89(7): 2568-2577. [本文引用:2]
[6] Daniels G, Green C, Smart E, et al. Differences between RhD-negative Africans and RhD-negative Europeans[J]. Lancet, 1997, 350(9081): 862-863. [本文引用:1]
[7] Okuda h, Kawano M, Iwamoto S, et al. The RhD gene is highly detectable in RhD-negative Japanese donors[J]. J Clin Invest, 1997, 100(2): 373-379. [本文引用:3]
[8] 徐群, 张世训, 张建业. 中国汉族群体RhD阴性个体D基因外显子多态性研究[J]. 中华医学遗传学杂志, 2001, 18(1): 39-42. [本文引用:2]
[9] 邵超鹏, 苏宇靖, 孔生生. Rh血型D抗原检测方法探讨[J]. 华南国防医学杂志, 2001, 15(1): 50-51. [本文引用:1]
[10] Maaskant-van Wijk PA, Faas BH, de Ruijter JA, et al. Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons[J]. Transfusion, 1998, 39(5): 1015-1021. [本文引用:1]
[11] Tonn T, Westrup D, Seidl C, et al. Sensitive determination of the RhD genotype in mixed samples using fluorescence based polymerase chain reaction[J]. Vox-Sang, 1997, 72(3): 177-181. [本文引用:1]
[12] Aubin JT, Le Van Kim C, Mouro I, et al. Specificity and sensitivity of RhD genotyping methods by PCR-based DNA amplification[J]. Br J haematol, 1997, 98(2)∶356-363. [本文引用:1]
[13] Hyland CA, Wolter LC, Saul A, et al. Three unrelated RhD gene polymorphisms identified among blood donors with Rhesus CCee(r'r') phenotypes[J]. Blood, 1994, 84(1): 321-326. [本文引用:1]
[14] 郭如华, 邢培清, 徐雅琴. 河南省部分RhD(-)献血者RhD基因多态性分析[J]. 郑州大学学报(医学版), 2002, 37(2): 210-212. [本文引用:1]
[15] 邵超鹏, 苏宇清, 吴国光. 中国人群真实RhD阴性个体和DEL型RhD基因研究[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2002, 31(5): 501-503. [本文引用:1]
[16] Cherif-Zahar B, Bloy C, Le Van Kim C, et al. Molecular cloning and protein structure of a human blood group Rh polypeptide[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(16): 6243-6247. [本文引用:3]
[17] Sun CF, Chou CS, Lai NC, et al. RhD gene polymorphisms among RhD-negative Chinese in Taiwan[J]. Vox Sang, 1998, 75(1): 52-57. [本文引用:3]
[18] Singleton BK, Green CA, Avent ND et al. The presence of an RhD pseudogene containing a 37 base pair duplication and a nonsense mutation in africans with the Rh D-negative blood group phenotype[J]. Blood, 2000, 95(1): 12-18. [本文引用:1]