引用本文
朱东安, 孙景勇, 范惠清. 一株福氏志贺菌中同时检出CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS. 2009, 24(7): 489-492
ZHU Dong'an, SUN Jingyong, FAN Huiqing. Detection of blaCTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated quinolone resistance determinant qnrS in an isolate of Shigella flexneri . Labratory Medicine, 2009, 24(7): 489-492  
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一株福氏志贺菌中同时检出CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶和质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS
朱东安1, 孙景勇2, 范惠清1
1. 上海市南汇区中心医院检验科,上海 201300
2. 上海交通大学附属瑞金医院临床微生物科,上海 200025

作者简介:朱东安,男,1971年生,主管技师,主要从事细菌耐药性检测和耐药性的机制研究。

基金:上海市南汇区科委课题(NKYL0601)
摘要
目的

明确1株福氏志贺菌RJ506对第3代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的分子机制。

方法

通过E-test检测RJ506对各抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),接合试验了解耐药性是否由质粒介导;用聚合酶链反应(PCR)分别扩增染色体和质粒介导的喹诺酮耐药基因并进行序列分析,检测染色体介导耐药的突变位点和质粒介导耐药的基因型;用PCR扩增CTX-M各组超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因并进行序列分析,检测ESBLs的基因型。

结果

RJ506对头孢噻肟和环丙沙星同时耐药,其染色体DNA旋转酶gyrA亚基的83位发现Ser→Leu突变,而gyrB和parC未见突变;该菌株同时含有ESBLs基因blaCTX-M-3和喹诺酮耐药基因qnrS,且分别位于不同的可接合质粒上。

结论

本实验在国内的志贺菌中检出质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS和CTX-M-3型ESBLs。

关键词: 福氏志贺菌; 超广谱β-内酰胺酶; 质粒; 喹诺酮耐药
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)07-0489-04
Detection of blaCTX-M-3 extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated quinolone resistance determinant qnrS in an isolate of Shigella flexneri
ZHU Dong'an1, SUN Jingyong2, FAN Huiqing1
1.Department of Clinical Laboratory, Nanhui Central Hospital, Shanghai 201300, China
2. Department of Clinical Microbiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To explore the molecular mechanism of co-resistance to third-generation cephalosporins(cefotaxime and ciprofloxacin) and fluoroquinolones in an isolate of Shigella flexneri RJ506.

Methods

The minimal inhibitory concentrations (MIC) of Shigella flexneri RJ506 were detected by E-test. The resistance to cefotaxime and ciprofloxacin was determined by conjugation.The mutation of chromosome-mediated resistance and the genotype of plasmid-mediated resistance were determined by polymerase chain reaction (PCR),and chromosome and the resistance gene of plasmid-mediated quinolone were amplified and sequenced.The extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) genes and their genotypes were amplified and sequenced by PCR.

Results

Shigella flexneri RJ506 was resistant to cefotaxime and ciprofloxacin simultaneously and exhibited the Ser83→Leu mutation in gyrA, but there was no mutation in gyrB and parC. The blaCTX-M-3 and qnrS exsisted on two different conjugative plasmids respectively.

Conclusions

This is a report of a qnrS gene and a blaCTX-M-3 gene in an isolate of Shigella flexneri from China.

Keyword: Shigella flexneri; Extended -spectrum β-lactamase; Plasmid; Quinolone resistance

细菌性痢疾的发病数居我国法定传染病的第3位, 各地时有爆发流行且其耐药也日益严重, 治疗严重细菌性痢病可选用的药物往往只剩下氟喹诺酮和第3代头孢菌素, 而本研究在一位临床腹泻患者粪便分离的1株福氏志贺菌对氟喹诺酮(环丙沙星)和第3代头孢菌素(头孢噻肟)同时耐药, 给抗感染治疗带来很大困难, 我们对该菌株耐药的分子机制进行了研究。

材料和方法
一、材料

1. 菌株 临床菌株RJ506, 2005年9月分离于瑞金医院肠道门诊1位腹泻患者的粪便, 经ATB半自动细菌鉴定仪和志贺菌分型血清鉴定为福氏志贺菌; 大肠埃希菌(ATCC 25922)为质控菌株; 大肠埃希菌(J53Azr)为接合试验受体菌(对叠氮化合物耐药)。

2. E-test药敏条 萘啶酸、环丙沙星、氨苄西林、头孢夫辛、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、阿莫西林-克拉维酸、头孢噻肟-克拉维酸、头孢他啶购自AB biodisk公司。

3. 其他试剂 10%叠氮钠购自江苏碧云天生物技术研究所, 聚合酶链反应(PCR)所需试剂(Taq酶、10 mmol/L dNTP等)购自上海生工工程公司, 引物由上海生工工程公司合成。

二、方法

1. 抗菌药物药敏试验和超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)确证试验 根据厂家产品的操作说明用E-test测定待检菌株对各种抗菌药物的敏感性, 并根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准解释试验结果和确证ESBLs。

2. 接合试验 (1)挑取供体菌(福氏志贺菌RJ506)和受体菌(大肠埃希菌J53Azr)单个菌落分别转种于2 mL LB肉汤中, 37 ℃振荡孵育4 h; (2)取各0.5 mL的供体菌和受体菌加入到4 mL LB肉汤中, 37 ℃孵育过夜, 取0.2 mL的混合液涂布于含10 μ g/mL头孢噻肟和100 μ g/mL叠氮钠的大豆胰蛋白平板(用于筛选对头孢噻肟耐药的质粒)及含有50 μ g/mL氯霉素和100 μ g/mL叠氮钠的水解酪蛋白胨(MH)平板(用于筛选对喹诺酮耐药的质粒), 37 ℃孵育过夜, 挑取在筛选平板上生长的接合子进行药敏试验。

3. PCR扩增耐药基因 (1)本研究PCR扩增的耐药基因包括: 染色体介导的喹诺酮耐药基因gyrA、gyrB和parC; 质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS、qnrA和qnrB; 质粒介导的CTX-M型ESBLs基因, 包括CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9 3组引物; (2) DNA模板的制备:取血平板上纯培养的菌落数个, 混悬于0.5 mL pH值8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)中, 煮沸10 min, 以7 000 r/min(离心半径为8 cm)离心5 min, 将上清液转移到无菌微量离心管中, 取2 μ L作为DNA模板; (3)PCR反应体系:引物序列、扩增片段大小及退火温度见表1。PCR循环基本条件为:94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环, 最后72 ℃延伸10 min。反应样品在三羟甲基氨基甲烷-乙酸(TAE)缓冲液、1.5%琼脂糖中电泳, 紫外灯下观察结果; (4)DNA序列分析:由上海英骏生物技术公司完成。

表1 PCR扩增的引物名称、序列、退火温度和扩增片段的大小
结 果
一、药敏试验

菌株RJ506 E-test结果显示其对头孢噻肟、萘啶酸、环丙沙星等抗菌药物耐药而对头孢他啶敏感, ESBLs确证试验阳性。见表2。

表2 各菌种E-test药敏试验结果
二、接合试验

菌株RJ506在不同的抗菌药物筛选平板上分别得到不同的接合子, 其中筛选于含头孢噻肟和叠氮钠的平板上的接合子RJ506C对头孢噻肟耐药, 对萘啶酸敏感, 筛选于含萘啶酸和叠氮钠的平板上的接合子RJ506N对萘啶酸耐药而对头孢噻肟敏感, 2种接合子的药敏结果见表2。

三、PCR及测序

1. 染色体介导的喹诺酮耐药基因 菌株RJ506的PCR产物经测序Blast对比后显示, 其gyrA基因有2个碱基突变, 从而导致其编码的氨基酸序列在83位和211位发生突变, 而gyrB和parC基因未见突变。

2. 质粒介导的喹诺酮耐药基因 菌株RJ506和接合子RJ506N qnrS基因PCR扩增阳性而RJ506C扩增阴性, 经测序Blast对比后显示, 其基因型与GenBank中qnrS基因完全相同; qnrA、qnrB基因的扩增均阴性, 见图1。

3. ESBLs基因 RJ506和接合子RJ506C CTX-M-9组引物扩增阳性, 经测序Blast对比后显示, 其基因型与GenBank中blaCTX-M-3基因完全相同, 见图1。

图1 qnrS基因及CTX-M-9组ESBLs PCR扩增结果

讨 论

细菌对第3代头孢菌素的耐药机制主要是产生质粒介导的ESBLs, 根据氨基酸序列和水解的底物谱不同ESBLs可分为TEM、SHV、CTX-M、PER、VEB等组别, 目前CTX-M组ESBLs已取代TEM、SHV组成为世界各地最流行的ESBLs[1], 我国最多见的ESBLs是 CTX-M-14和CTX-M-3。ESBLs主要存在于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中, 在志贺菌中的检出则较少见, 最近熊自忠等[2, 3]在安徽的宋氏志贺菌和福氏志贺菌中检出了CTX-M-14型ESBLs, 而在本试验中我们经E-test确证试验证实志贺菌RJ506为产ESBLs菌, PCR扩增和序列分析显示其基因型为CTX-M-3, 且这种酶的耐药基因位于质粒上, 接合试验显示耐药质粒可以在不同菌株间转移, 导致耐药基因的扩散。

喹诺酮类抗菌药物的作用靶位为DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ , 前者由gyrA和gyrB 2个亚基组成, 后者由parC和parE 2个亚基组成, 染色体介导的细菌对喹诺酮类药物的耐药性主要是由于gyrA、gyrB或parC亚基中的某些氨基酸发生了突变, 其中gyrA突变更为常见, 在临床菌株中最多见的是喹诺酮类耐受决定区(QRDR)83位氨基酸的突变, 其次是87位[4]。本研究通过对菌株RJ506的gyrA、gyrB和parC基因PCR扩增并测序分析后发现, 在gryA的83位发生了突变, 即由Ser(TCG)突变为Leu(TTG), 同时在211位也有一个H(CAC)→ Y(TAC)突变, 不过这一位点的突变位于QRDR之外, 其对细菌耐药性的影响也未见报道。通过对GenBank中数据库的搜索发现, 211位点的突变只是出现在分离自中国的志贺菌中, 其临床意义尚需进一步研究。另外菌株RJ506的gyrB和parC基因中均未发现任何碱基突变, 一般认为gyrA83单独的突变只介导细菌对氟喹诺酮类低水平的耐药, 而菌株RJ506对环丙沙星高度耐药(MIC> 256 μ g/mL), 所以可能还存在其他机制的协同作用。

质粒介导的喹诺酮耐药是近年来的一个研究热点, Wang等[5]在国内的大肠埃希菌中检出了质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA, 最近Hu等[6]在国内的1株肺炎克雷伯菌中报道了qnrS, 而本研究中经PCR扩增和序列分析, 发现福氏志贺菌RJ506及其接合子RJ506N携带有质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS, 而且接合试验结果也显示接合子RJ506N与结合前(J53)相比其对喹诺酮类的耐药性有一定的上升, 如对萘啶酸的耐药性上升了3倍(MIC值由3 μ g/mL上升到12 μ g/mL), 由敏感变为中介, 而对环丙沙星的耐药性则上升了30倍(MIC值由0.016 μ g/mL上升到0.5 μ g/mL), 但仍处于敏感范围内。 Martí nez-Martí nez等[7]研究均发现携带有qnrA的质粒(pMG252)可进一步提高含gyrA突变的临床大肠埃希菌对喹诺酮的耐药性, 所以菌株RJ506可能也是由gyrA突变和qnrS的协同作用导致其对喹诺酮的高度耐药。

总之, 在本研究中我们在国内的一株福氏志贺菌中检出了CTX-M-3型ESBLs和qnrS喹诺酮耐药基因, 这2种基因分别位于不同的质粒上并可通过接合传递。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[3] 熊自忠, 李涛, 李慧, 等. 福氏志贺菌中超广谱β-内酰胺酶的基因型分析[J]. 中华传染病杂志, 2006, 24(5): 296-300. [本文引用:1]
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[5] Wang M, Tran JH, Jacoby GA, et al. Plasmid-mediated quinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli from Shanghai, China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(7): 2242-2248. [本文引用:1]
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[7] Martínez-Martínez L, Pascual A, Jacoby GA. Quinolone resistance from a transferable plasmid[J]. Lancet, 1998, 351(9105): 797-799. [本文引用:1]