引用本文
叶魏, 方筠, 韩晓辉, 阎俊, 章琪, 曾艺雄, 徐剑, 张跃建, 孟成艳. 一种新型结核分枝杆菌感染快速检测方法的应用. 2009, 24(7): 485-488
YE Wei, FANG Yun, HAN Xiaohui, YAN Jun, ZHANG Qi, ZENG Yixiong, XU Jian, ZHANG Yuejian, MENG Chengyan. Application of a new method for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis . Labratory Medicine, 2009, 24(7): 485-488  
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一种新型结核分枝杆菌感染快速检测方法的应用
叶魏1, 方筠1, 韩晓辉1, 阎俊1, 章琪1, 曾艺雄1, 徐剑2, 张跃建2, 孟成艳1
1. 上海国际旅行卫生保健中心,上海 200335
2. 上海复星长征医学科学有限公司,上海 200433

作者简介:叶魏,女,1975年生,硕士,主治医师,主要从事免疫学研究。

基金:上海出入境检验检疫局科研基金项目(HK033-2007)
摘要
目的

探讨酶联免疫斑点试验(ELISPOT)快速诊断结核病的价值。

方法

选取15例确诊为活动性肺结核的患者和100例入境人员的外周抗凝全血标本,采用ELISPOT检测试剂盒(T SPOT-TB)测定结核杆菌特异抗原刺激反应的效应T淋巴细胞数量。

结果

T SPOT-TB检测结核病的敏感性为93.3%,特异性为100.0%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为81.8%。采用该方法检测的结核潜伏感染率与病例来源呈密切相关,而与年龄和性别无相关性。

结论

T SPOT-TB的敏感性和特异性均较高,可用于结核感染的快速检测,但无法判断结核的活动性或潜伏感染。

关键词: 酶联免疫斑点试验; 结核分枝杆菌; 快速检测
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)07-0485-04
Application of a new method for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis
YE Wei1, FANG Yun1, HAN Xiaohui1, YAN Jun1, ZHANG Qi1, ZENG Yixiong1, XU Jian2, ZHANG Yuejian2, MENG Chengyan1
1.Shanghai International Travel Healthcare Center, Shanghai 200335,China
2.Shanghai Fosun Long March Medical Science Company Limited, Shanghai 200433, China
Abstract
Objective

To study the value of the enzyme-linked immunosorbent spot test(ELISPOT) in the rapid diagnosis of tuberculosis.

Methods

100 anti-coagulated peripheral whole blood samples from entry-exit personnel and 15 samples from tuberculosis patients being diagnosed in Huashan hospital were detected by ELISPOT kit (T SPOT-TB) to determine the amount of tuberculosis antigen specific effecter T lymphocytes.

Results

The sensitivity and specificity of ELISPOT test were 93.3% and 100.0% respectively. The positive predictive value and negative predictive value were 100.0% and 81.8% respectively. The positive rate of T SPOT-TB was correlated with the source of cases, but not with sex or age.

Conclusions

Both the sensitivity and the specificity of T SPOT-TB kit are relatively high, which is applicable for rapid detection of tuberculosis infection. This technology can not differentiate between active tuberculosis infection and latent infection.

Keyword: Enzyme-linked immunosorbent spot; Mycobacterium tuberculosis; Rapid test

结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病。由于获得性免疫缺陷综合征、吸毒、免疫抑制剂的使用、酗酒与贫困、难民迁移等诸多因素的影响, 结核及其他分枝杆菌所致的感染发病率呈逐年上升趋势。如何能够快速、准确的诊断结核病, 有效的控制结核病的继续蔓延, 已经成为需要引起极大重视的问题。传统的结核病检测方法如痰涂片染色法、培养法、免疫学方法和分子生物学方法等, 都因在检测的敏感性、特异性、检测周期、检测成本等方面的各种缺陷限制了其推广应用。酶联免疫斑点试验(ELISPOT)是由Czerkinsky等[1]于1983年根据酶联免疫吸附试验(ELISA)建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术, 并由Lalvani等[2] 首先将其应用于结核病的快速诊断, 为结核病的实验室检测提供了一条新途径。本研究选取上海口岸入境人员为对象, 以ELISPOT检测其外周血结核特异抗原T淋巴细胞的数量, 探讨该技术在结核分枝杆菌快速诊断中的应用。

材料和方法
一、 研究对象

1. 标本采集 研究2007年8月至2007年11月来上海国际旅行卫生保健中心接受健康评估的入境人员, 主要为留学人员, 随机抽取人外周抗凝全血标本共100份。其中将来自结核低发的欧美地区、胸片检测阴性、结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)皮试阴性且不伴有咳嗽、咳痰、血痰或咯血、胸闷、气短、胸痛、疲乏等临床表现的入境人员9例设为健康对照组。同一时间内抽取复旦大学附属华山医院新诊断为肺结核的患者共15例设为阳性对照组, 阳性对照病例均符合中华人民共和国卫生部制定的下列诊断标准之一:(1)2次痰涂片抗酸杆菌阳性或痰培养分枝杆菌阳性, 胸部X线片有肺结核特征病灶; (2)涂片或培养2次以上阴性, 胸部X线片示活动性肺结核征象, 伴有咳嗽、咳痰、血痰或咯血、胸闷、气短、胸痛、疲乏等临床表现。

2. 人员构成 男59例, 女41例; 国家构成:亚洲59例、非洲32例、欧洲6例、北美洲2例、南美洲1例; 年龄构成:17~20岁30例、21~30岁28例、31~40岁20例、41~50岁19例、> 50岁3例。

3.标本处理 所有标本均采集于4 mL肝素抗凝的真空采血管内, 血标本注入管子后, 立即轻轻颠倒5次, 充分混匀, 并置于室温保存。

二、实验方法

1. 实验试剂及耗材 结核菌感染ELISPOT检测试剂盒T SPOT-TB(英国Oxford Lmmunotec Ltd); BD细胞分离管(BD Vacutainer CPT tube) ; 实验仪器:Esco二级生物安全柜、CO2细胞培养箱。

2. 外周血单个核细胞(PBMC)的分离与计数 采集4 mL外周血标本于肝素抗凝的真空采血管内, 血标本注入管子后, 立即轻轻颠倒5次, 充分混匀。1 800 r/min(离心半径为12 cm)18 ℃离心28 min, 用吸管吸起白细胞层, 加入预温的培养基1640至10 mL; 1 200 r/min(离心半径为12 cm)18 ℃离心7 min, 细胞用吸管悬浮于10 mL培养液; 900 r/min(离心半径为12 cm)18 ℃离心7 min, 细胞沉淀悬浮于1 mL预温培养基中, 分别吸取10 μ L进行活细胞计数。

3. 体外ELISPOT检测γ 干扰素(INF-γ ) 分别加入50 μ L培养基、阳性质控物、结核菌特异抗原A和B于相对应阴性对照孔、阳性对照孔、A和B检测孔, 加入100 μ L包含2.5× 105 PBMC的培养基到每个阴性、阳性对照孔和抗原A、B检测孔, 37 ℃ 5% CO2孵育16~20 h, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗板4次, 加入50 μ L工作酶复合物溶液至每个孔中, 2~8 ℃孵育60 min, 200 μ L PBS洗板4次, 加入50 μ L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝底物溶液(BCIP/NBT)至所有孔中, 室温反应7 min, 用蒸馏水或去离子水充分洗涤孔的内部, 反应板置于背光、通风良好的环境干燥后, 用显微镜计数每个孔中的有色斑点。

4. 结果判定标准 阴性对照斑点数为0~5个, 任何一个检测孔计数减去阴性孔计数≥ 6个判断为阳性; 如果阴性对照斑点数≥ 6个, 检测孔斑点数≥ 2倍阴性对照孔斑点数, 判定为阳性。

三、实验步骤

1. 对9例健康对照和15例结核病例进行ELISPOT检测, 评价ELISPOT的敏感性和特异性。

2. 对100例普通入境人员进行ELISPOT、PPD和胸片检查, 对ELISPOT和传统方法进行诊断价值的比较。

3. 了解普通入境人员结核感染状况以及人口学分布。

结 果
一、对T SPOT-TB诊断价值的评估

确诊为结核病的病例15例为阳性对照, 来自结核病低发的欧美地区且PPD皮试阴性者9例设为健康对照, 2组检测的阳性率分别为93.3%(14/15)与0, 此技术用于确诊为结核且未经治疗的患者的敏感性为93.3%, 特异性为100.0%, 阳性预测值为100.0%, 阴性预测值为81.8%。

二、ELISPOT和传统检测方法的一致性

在100例入境人员的血液标本中, 有12例为ELISPOT阳性标本, 其中1例经痰涂片抗酸染色和BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养为阳性, 胸片也证实为活动性结核; 其余11例痰涂片及培养均为阴性。在以上11例痰涂片及培养阴性标本中, 有3例标本的X线检查结果为陈旧性结核, 考虑为既往感染, 其余8例胸片为阴性, 考虑存在潜伏结核感染的可能。在ELISPOT阴性的人群中, 均没有发现痰涂片和培养阳性, 胸片亦未发现结核病变, 见表1。本实验进一步将检出的12例T SPOT-TB阳性病例进行PPD皮试, 发现11例标本的PPD试验为阳性, 所有T SPOT-TB阳性病例部分来自非卡介苗接种区, T SPOT-TB检测结果与PPD试验存在较高的一致性。

表1 ELISPOT和传统检测方法的相关性
三、T SPOT-TB在入境人员体检中的检测情况

1. 检测结果与人员性别构成的研究 本次试验标本来源为男59例、女41例, 共检测出T SPOT-TB阳性标本12例, 其中男10例(16.95%)、女2例(4.88%), 经列表卡方检验, 差异无统计学意义(χ 2=2.29, P> 0.05)。

2. 检测结果与人员年龄结构的研究 检测结果经相关回归分析, 相关系数为0.248, 显示结核的感染率与年龄结构无相关性, 具体另有文章阐述[3]。

3. 检测结果与人员地区分布的研究 随机抽取的来自亚洲、非洲、美洲等共35个国家的100例标本, 其中亚洲59例、非洲32例、欧洲6例、北美洲2例、南美洲1例, T SPOT-TB阳性标本集中在亚洲和非洲国家人群中检出, 分别为亚洲5例和非洲7例, 而在欧洲和美洲国家来源的标本中均未检出阳性标本, 经列表卡方检验, 结核感染率在亚洲、非洲和其他国家之间的差异存在统计学意义(χ 2=6.1, P< 0.05), 具体另有文章阐述[3]。

讨 论

快速、准确进行结核病的有效检出是多年来困扰结核病实验室诊断领域的一个问题。近年来, 一种基于ELISPOT的快速检测结核病的血液学诊断方法开始得到应用[3]。

国外已将ELISPOT作为常规检测结核, 尤其是早期和潜伏结核感染的方法之一, 但国内一直都很难开展对该方法诊断价值的研究, 其原因是多方面的。本研究首次选择了来自欧美结核低发地区, 且PPD及胸片都阴性的人员作为健康对照, 并以确诊为肺结核的患者作为阳性对照, 评价该方法的敏感性和特异性。结果显示, ELISPOT检测活动性结核敏感性为93.3%, 特异性为100.0%, 阳性预测值为100.0%, 阴性预测值为81.8%。由于样本量有限, 还需进行大规模的临床试验。

与传统检测结核方法比较发现, ELISPOT检出的12份阳性标本中, 1例确诊为开放性结核病例, 3例X线检查为陈旧性结核; 而在ELISPOT阴性标本中未发现结核患者。进一步分析, 12例T SPOT-TB阳性标本中, 11例标本的PPD试验为阳性, 已知上述阳性病例部分来自非卡介苗接种区, T SPOT-TB检测结果与PPD试验存在较高的一致性, 符合相关的文献报道[4], 提示若用PPD皮试结果来衡量, 该方法具有较好的特异性。考虑到在目前世界上很多国家和地区广泛接种卡介苗, 可能会影响PPD试验的结果, 因为卡介苗中不存在早期分泌抗原靶点(ESAT-6)和培养滤过蛋白10(CFP-10)抗原(遗传基因RD1区丢失), 故接种不会对T SPOT-TB的实验结果产生干扰和假阳性。鉴于口岸出入境人员的来源多样, 可来自卡介苗接种区及非卡介苗接种区, 是否能用T SPOT-TB来代替PPD检测法, 尚需增加样本量和样本来源作进一步的探讨。

本研究结果也表明, T SPOT-TB阳性率与性别、年龄无相关性, 而与病例来源呈相关性, 上述试验结果符合结核流行病学调查结果。T SPOT-TB不仅具有检测敏感、特异、快速等优势, 而且还能对结核潜伏感染病例进行及时的检出。据悉, 在英国和欧盟部分国家, T SPOT-TB检测结果阳性病例一律被要求进行结核感染的随访, 以便早期发现患者并做早期的诊治。本实验未能对12例阳性标本进行随访, 无法得到T SPOT-TB如何应用在结核潜伏感染检测中的数据, 这可以作为课题的后续研究内容。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Czerkinsky CC, Nilsson LA, Nygren H, et a1. A solid-phase enzyme-linked immunospot(ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(1-2): 109-121. [本文引用:1]
[2] Lalvani A, Pathan AA, McShane H, et a1. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells[J]. Am J Respir Crit Care Med, 200l, 163(4): 824-828. [本文引用:1]
[3] 叶魏, 章琪, 方筠, 等. 酶联免疫斑点技术在出入境人员结核分枝杆菌快速诊断检测中的应用[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2008, 31(3): 185-188. [本文引用:3]
[4] Ewer K, Deeks J, Alvarez L, et a1. Comparison of T-cel1-based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak[J]. Lancet, 2003, 361(7): 1168-1173. [本文引用:1]