引用本文
卢培, 陆慧琦, 韩焕兴, 朱学源, 黄秋芳, 龚炜. 2种检测VEGF-C和VEGFR-3基因表达的方法在诊断食管癌淋巴结转移中的价值. 2009, 24(6): 446-449
LU Pei, LU Huiqi, HAN Huanxing, ZHU Xueyuan, HUANG Qiufang, GONG Wei. The value of two methods detecting the VEGF-C and VEGFR-3 gene expression on lymphatic metastasis of esophageal carcinoma. Labratory Medicine, 2009, 24(6): 446-449  
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2种检测VEGF-C和VEGFR-3基因表达的方法在诊断食管癌淋巴结转移中的价值
卢培1, 陆慧琦2, 韩焕兴2, 朱学源1, 黄秋芳1, 龚炜1
1.上海市第八人民医院检验科,上海 200235
2.第二军医大学附属长征医院实验诊断科,上海 200003

作者简介:卢 培,男,1967年生,学士,副主任技师,主要从事临床免疫学研究。

基金:上海市科技攻关医学临床研究项目(064119638)
摘要
目的

评价实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)和免疫组织化学法(IHC)测定食管癌组织中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)基因表达在诊断食管癌淋巴结转移中的意义。

方法

分别采用实时FQ-RT-PCR和IHC检测食管癌组织中VEGF-C/VEGFR-3 mRNA和VEGF-C/VEGFR-3蛋白。

结果

有淋巴结转移组食管癌组织VEGF-C/VEGFR-3 mRNA和蛋白的表达均显著高于无淋巴结转移组;实时FQ-RT-PCR检测VEGF-C mRNA诊断食管癌淋巴结转移的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率与IHC检测VEGF-C蛋白差异无统计学意义;实时FQ-RT-PCR检测食管癌组织VEGFR-3 mRNA诊断食管癌淋巴结转移的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率均明显高于IHC ( P<0.05)。

结论

实时FQ-RT-PCR检测VEGF-C/VEGFR-3 mRNA可较好地反映食管癌淋巴结转移状况。

关键词: 血管内皮生长因子-C; 血管内皮生长因子受体-3; 食管癌; 淋巴结转移; 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应; 免疫组织化学法
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)06-0446-04
The value of two methods detecting the VEGF-C and VEGFR-3 gene expression on lymphatic metastasis of esophageal carcinoma
LU Pei1, LU Huiqi2, HAN Huanxing2, ZHU Xueyuan1, HUANG Qiufang1, GONG Wei1
1.Department of Clinical Laboratory,the Eighth People's Hospital,Shanghai 200235,China
2. Department of Laboratory Diagnostics, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003,China
Abstract
Objective

To evaluate the significance of real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (FQ-RT-PCR) and immunohistochemistry (IHC) detecting the vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) and vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) gene expression in diagnosing lymphatic metastasis of esophageal carcinoma.

Methods

The real-time FQ-RT-PCR and IHC were used to detecting VEGF-C and VEGFR-3 genes and their protein expressions in esophageal carcinoma.

Results

VEGF-C and VEGFR-3 mRNA and their protein expressions in carcinoma tissue from patients with lymphatic metastasis of esophageal carcinoma were significantly higher than that in carcinoma tissue from patients without lymphatic metastasis of esophageal carcinoma. The sensitivity, specificity, conformity with pathological diagnosis of real-time FQ-RT-PCR detecting VEGF-C mRNA in carcinoma tissue on diagnosing lymphatic metastasis of esophageal carcinoma were not significantly higher than IHC detecting protein. The sensitivity, specificity, conformity with pathological diagnosis of real-time FQ-RT-PCR detecting VEGFR-3 mRNA in carcinoma tissue on diagnosing lymphatic metastasis of esophageal carcinoma were significantly higher than IHC detecting protein ( P<0.05).

Conclusions

The real-time FQ-RT-PCR is a better method in diagnosing lymphatic metastasis of esophageal carcinoma.

Keyword: Vascular endothelial growth factor-C; Vascular endothelial growth factor receptor-3; Esophageal carcinoma; Lymphatic metastasis; Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; Immunohistochemistry

食管癌是消化道常见恶性肿瘤, 影响食管癌预后的因素很多, 淋巴结转移是食管癌术后复发常见的原因之一。近年来血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)及其受体血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)在肿瘤淋巴结转移中的作用倍受重视[1]。免疫组织化学法(IHC)检测食管癌组织中VEGF-C、VEGFR-3常被认为是诊断食管癌淋巴结转移较好的方法, 但受人为因素影响大。本研究分别应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)和IHC检测食管癌组织VEGF-C、VEGFR-3基因表达水平, 评价他们在诊断食管癌淋巴结转移中的价值。

材料和方法
一、标本来源

2007年8月至2008年3月在第二军医大学附属长征医院胸外科接受手术治疗的原发性食管癌患者40例, 男29例, 女11例, 年龄46~74岁, 符合1990年《中国常见恶性肿瘤诊治规范》中原发性食管癌诊断标准, 临床病理资料完整, 其中经病理学诊断证实有淋巴结转移者24例, 无淋巴结转移者16例。术前未接受任何放射和化学治疗。手术后在食管癌组织原发灶取材, 用40 g/L多聚甲醛固定备常规苏木精-伊红染色(HE)切片和IHC使用。取癌组织(避开坏死、炎症部位)立即置液氮中, 继移置-70 ℃备用。

二、主要试剂和仪器

兔抗人VEGF-C多克隆抗体、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体(丹麦Dako公司), 生物素-链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)试剂盒、3, 3-二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京达科为生物技术有限公司), 组织总RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒(上海华舜公司), 逆转录试剂盒、PCR试剂盒、pMD18-T载体试剂盒、实时PCR试剂盒、DNA marker (DL2000)(大连宝生物工程公司)。DU640紫外分光光度仪(美国Beckman公司), PTC-200扩增仪(BIO-RAD公司), ABI Prism 7000荧光定量分析仪(美国ABI公司)。

三、IHC及其判断标准

1.IHC 操作步骤按照试剂盒说明书进行。VEGF-C和VEGFR-3抗体稀释浓度为1:100, 以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

2.IHC判断标准 VEGF-C定位于细胞浆, VEGFR-3定位于细胞浆和癌巢周围间质细胞, 2种蛋白均以细胞浆的着色情况为标准, 阳性染色均为棕黄色颗粒。先在低倍镜下选取最强着色区, 然后选10个高倍镜视野(× 400), 分别记数100个细胞, 其颜色深浅参考文献[2]评分:细胞浆无棕黄色颗粒为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。染色细胞所占百分比打分:无阳性细胞为0分、> 0~≤ 25%为1分、> 25%~≤ 50%为2分、> 50%~≤ 75%为3分、> 75%为4分。2项乘积得分≥ 3分为阳性。

四、实时FQ-RT-PCR

根据参考文献[3]进行。

五、统计学方法

用SPSS 11.5软件作统计分析, 由于测定数据为非正态分布, 所有定量数据以中位数及范围表示。两组间比较分析采用Mann-Whitney U非参数检验方法, 2种方法检测结果与病理学诊断间的符合程度用符合率表示, 符合率之间的比较和两组间阳性率比较均采用χ 2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。以诊断食管癌淋巴结转移的敏感性和特异性作为性能评价指标。

结 果
一、IHC测定食管癌患者癌组织VEGF-C和VEGFR-3蛋白结果

40例食管癌患者中淋巴结转移组癌组织VEGF-C蛋白阳性率(79.17%, 19/24)明显高于无淋巴结转移组(25.00%, 4/16), 差异有统计学意义(P< 0.01)。淋巴结转移组癌组织VEGFR-3蛋白阳性率(83.33%, 20/24)明显高于无淋巴结转移组(31.25%, 5/16), 差异亦有统计学意义 (P< 0.01)。IHC测定癌组织VEGF-C和VEGFR-3蛋白对食管癌淋巴结转移的诊断性能结果见表1。

表1 IHC测定VEGF-C /VEGFR-3 蛋白对食管癌淋巴结转移的诊断性能(%)
二、食管癌患者癌组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA测定结果

有淋巴结转移的食管癌患者癌组织用实时FQ-RT-PCR测得的VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA表达量均显著高于无淋巴结转移组(P均< 0.001), 见表2。

表2 食管癌患者癌组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA测定结果(拷贝数/μ g 总RNA)
三、癌组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA对食管癌淋巴结转移的诊断性能

根据受试者工作特性(ROC)曲线, 以无淋巴结转移组癌组织为对照, 将癌组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA诊断食管癌淋巴结转移临界值分别定为1.70× 105拷贝数/μ g总RNA和3.83× 104拷贝数/μ g总RNA, 见图1、2, 据此得出的癌组织VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA对食管癌淋巴结转移的诊断性能结果见表3。

图1 VEGF-C mRNA对食管癌淋巴结转移诊断的ROC曲线

图2 VEGFR-3 mRNA对食管癌淋巴结转移诊断的ROC曲线

表3 实时FQ-RT-PCR测定VEGF-C/VEGFR-3mRNA对食管癌淋巴结转移的诊断性能
四、IHC与实时FQ-RT-PCR检测VEGF-C和 VEGFR-3基因表达对食管癌淋巴结转移的诊断性能评价

实时FQ-RT-PCR测定VEGF-C mRNA诊断食管癌淋巴结转移的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率均高于IHC, 但差异无统计学意义 (P> 0.05); 实时FQ-RT-PCR测定VEGFR-3 mRNA的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率均高于IHC, 差异有统计学意义 (P< 0.05)。实时FQ-RT-PCR测定食管癌组织VEGFR-3 mRNA对食管癌淋巴结转移的诊断性能优于IHC。

讨 论

食管癌的发病和转移机制尚未完全阐明, 早期主要通过淋巴结转移至周围器官和组织, 许多患者在中晚期确诊时, 多已伴有淋巴转移, 疗效不佳, 预后较差。因此研究癌细胞淋巴结转移机制, 寻找提示淋巴结转移的分子标志物有着重要临床意义。

VEGF-C和VEGFR-3分别由Joukov等[4]和Aprelikova等[5]从人类前列腺癌细胞、人的胚胎和白血病细胞cDNA文库中克隆得到。人VEGF-C有促进毛细管结构形成作用, 在人体心脏、胎盘、骨骼肌、卵巢、小肠等组织中均有弱表达; VEGFR-3在胚胎期是胚胎血管形成的必需因素, 在血管和淋巴管内皮细胞都有分布, 成年后该受体仅表达于淋巴管内皮细胞, 是目前发现的淋巴管生成的主要受体, 也是淋巴管内皮细胞的特异性标志物[6, 7]。

肿瘤细胞能产生大量VEGF-C, 通过VEGF-C/VEGFR-3自分泌或旁分泌途径与受体VEGFR-3结合, 引起VEGFR-3的激活, 使受体自身磷酸化, 细胞有丝分裂增加, 诱导淋巴管内皮细胞增殖, 从而使淋巴管扩张或增生, 形成新生的淋巴管, 加大了肿瘤细胞自淋巴管转移的机会[8, 9], 因此VEGF-C/VEGFR-3在肿瘤的淋巴管生成和淋巴结转移过程中发挥着重要的作用。

本研究分别使用IHC和实时FQ-RT-PCR检测食管癌患者癌组织VEGF-C和VEGFR-3的表达, 结果均显示VEGF-C和VEGFR-3在淋巴结转移组与无淋巴结转移组之间差异有统计学意义(IHC 2指标P均< 0.01, FQ-RT-PCR 2指标P值均< 0.001), 提示VEGF-C和VEGFR-3与肿瘤淋巴结转移之间关系密切, 分别与Saintigny等[9]和张红新等[10]的结果基本一致。

目前临床常用的食管癌患者癌组织VEGF-C和VEGFR-3检测方法主要有蛋白质水平的IHC和mRNA水平的RT-PCR, 然而国内尚缺乏准确定量测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA的方法, 使VEGF-C 和VEGFR-3 的研究主要局限于定性水平。本研究采用IHC检测VEGF-C和VEGFR-3诊断食管癌淋巴结转移的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率与张红新等[10]的结果相近。采用实时FQ-RT-PCR应用ROC曲线确定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA在癌组织的临界值分别为1.70× 105拷贝数/μ g总RNA和3.83× 104拷贝数/μ g总RNA。在此临界值下, 癌组织中VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA对食管癌淋巴结转移诊断的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率分别高于IHC检测结果; 实时FQ-RT-PCR与IHC检测食管癌组织VEGFR-3基因表达对食管癌淋巴结转移诊断的敏感性、特异性以及与病理学诊断的符合率的差异有统计学意义(P均< 0.05)。实时FQ-RT-PCR作为基因表达的常规测定方法操作相对简单, 易于自动化, 克服IHC人为因素比较多的缺点, 且实时FQ-RT-PCR测定结果客观并可量化是其突出的优势。

综上所述, 用实时FQ-RT-PCR测定VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA, 具有敏感、稳定、重现性好的特点, 检测性能优于IHC。扩大研究样本以及追踪患者病情的演变和预后, 以进一步证实VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA作为分子标志物的可靠性, 其可以作为临床诊断食管癌淋巴结转移新的常规检测手段[11]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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