引用本文
王尚云, 张一兵, 王霞, 罗喜钢, 高雅文, 金辉, 姜薇. 鸟氨酸氨基甲酰转移酶速率法测定的初步探讨. 2009, 24(6): 438-440
WANG Shangyun, ZHANG Yibing, WANG Xia, LUO Xigang, GAO Yaweng, JIN Hui, JIANG Wei. Preliminary study of a kinetic method of ornithine carbamoyltransferase determination. Labratory Medicine, 2009, 24(6): 438-440  
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鸟氨酸氨基甲酰转移酶速率法测定的初步探讨
王尚云1, 张一兵2, 王霞3, 罗喜钢2, 高雅文1, 金辉2, 姜薇2
1.辽宁医学院,辽宁 锦州 121000
2.辽宁医学院附属第三医院检验科,辽宁 锦州 121000
3.盘锦油田第二职工医院检验科,辽宁 盘锦 124000

作者简介:王尚云,女,1981年生,学士,主要从事体液酶学研究。

摘要
目的

建立鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)自动化分析的方法。

方法

在磷酸盐缓冲液(pH值7.2)条件下,以瓜氨酸为底物,经一系列酶偶联反应,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH+H+)被氧化为氧化型辅酶Ⅰ(NAD+),340 nm处测定吸光度( A)变化值, A值下降的速率与待测样本中的OCT含量成正比关系,间接求出OCT的活性。

结果

本法最适pH值为7.2,最适底物浓度为2.0 mmol/L。批内、批间平均变异系数( CV)分别为3.80%、4.08%。米氏常数(Km)值为0.16 mmol/L。回收率达91.56% 。在320 U/L内线性良好。参考范围为0~18 U/L。

结论

本方法能够快速、简便、准确的测定OCT活性,适用于各类全自动生化分析仪。

关键词: 鸟氨酸氨基甲酰转移酶; 速率法; 自动化分析
中图分类号:Q555 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)06-0438-03
Preliminary study of a kinetic method of ornithine carbamoyltransferase determination
WANG Shangyun1, ZHANG Yibing2, WANG Xia3, LUO Xigang2, GAO Yaweng1, JIN Hui2, JIANG Wei2
1. Liaoning Medical University, Liaoning Jinzhou 121000, China
2.Department of Clinical Laboratory, affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Liaoning Jinzhou 121000, China
3. Department of Clinical Laboratory, The Second Staff-worker Hospital of Panjin Oil Field, Liaoning Panjin 124000, China
Abstract
Objective

To establish a kinetic monitoring assay for detecting ornithine carbamoyltransferase(OCT).

Methods

Citrulline was used as substrate, OCT catalyzed the substrate in phosphate buffer, after a series of enzyme pair association response,NADH+ H+ was oxidized to NAD+. The activity of OCT was determined at 340 nm.

Results

The optimal pH was 7.2 and optimal substrate concentration was 2.0 mmol/L. Inter-assay coefficient of variation ( CV) value was 3.80% and intra-assay CV value was 4.08%. Km was 0.16 mmol/L. The average rate of recovery was 91.56%.The linearity reached 320 U/L. The normal reference value (100 healthy subjects)was 0~18 U/L.

Conclusions

This technique for OCT determination is rapid,simple and accurate,and suitable for any kind of automatic biochemistry analyzer.

Keyword: Ornithine carbamoyltransferase; Kinetic method; Automatic analysis

鸟氨酸氨基甲酰转移酶(ornithine carbamoyltransferase, OCT)是一种氨基转移酶, 主要存在于肝脏线粒体内, 其含量约占人体OCT总量的99%[1], 是肝脏的特异性酶。OCT的作用是在鸟氨酸循环中催化鸟氨酸转化为瓜氨酸, 在体内具有重要的生理作用, 是解氨毒和尿素生物合成的重要步骤。OCT是肝胆疾病的敏感指标。然而, 以往的终点测定法和酶联免疫吸附试验(ELISA)由于各自的局限性, 不能作为常规方法应用于临床, 从而制约了OCT在肝胆疾病中的诊断价值。因此, 我们根据实验条件, 以瓜氨酸为底物, 采用酶偶联反应原理设计了OCT的速率测定法, 在自动生化分析仪上对该项目进行测定, 从而建立了OCT的动力学测定方法。

材料和方法
一、研究对象

选择锦州市中心血站健康体检者100名(无肝、胆、肾、肠、免疫性等疾病者), 男56名, 女44名, 年龄20~60岁。

二、仪器和试剂

1. 仪器 Beckman CX9全自动生化分析仪。

2. 试剂 (1)试剂1(R1):0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.2), 12 mmol/L α -酮戊二酸, 0.7 kU/L谷氨酸脱氢酶, 0.4 mmol/L 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH+H+), 4 mmol/L 二磷酸腺苷(ADP); (2) 试剂2(R2):2 mmol/L 瓜氨酸, 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.2)。

三、原理

在磷酸盐缓冲液(pH值7.2)条件下, OCT催化瓜氨酸生成NH3, NH3在α -酮戊二酸和NADH+H+存在下, 通过谷氨酸脱氢酶催化生成谷氨酸, 同时NADH+H+被氧化成氧化型辅酶I(NAD+), NADH+H+在340 nm处有强吸收峰, 其吸光度(A)值下降速率与待测样本中OCT含量成正比关系, 在340 nm波长下测定A值变化, 取线性范围内△ A/min, 间接计算OCT活性。单位定义:在最适条件下, 反应体系中每升样本1 min内使1 μ mol NADH+H+转化为NAD+ 所需要OCT的量为一个国际单位 。

四、方法

1.测定参数 测定方式:连续监测法; 温度:37 ℃; 波长:340 nm; 比色杯光径: 0.5 cm; 样本体积: 25 μ L; R1: 240 μ L; 试剂空白读数时间: 290 s; R2: 45 μ L; 加入时间:350 s; 测定始读时间: 410 s; 测定终读时间: 590 s; F值为-3 987。

2.计算 OCT(U/L) = △ A/min× (106× 310)/(6.22× 103× 0.5× 25)=△ A/min× 3 987

五、实验条件的选择

1. 酶促反应最适pH值和最佳浓度 基质液浓度固定为2.0 mmol/L, 配制不同浓度(0.067、0.1、0.2 mmol/L)和pH值(6.8、7.0、7.2、7.4、7.6)的磷酸盐缓冲液, 对同一份样本测定, 观察OCT在不同浓度和不同pH值的磷酸盐缓冲液条件下酶活性的变化。

2.米氏常数(Km)的测定 在pH 值7.2 条件下, 分别用0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的底物浓度测定同一份样本所得△ A/min, 按Michaelis-Menten方程V=VS /Km +S, 在其他参数固定不变的条件下, 按双倒数法作图。

3. 最适底物浓度 根据km值求得理论最适底物浓度范围(一般为Km的10~20倍), 在此范围内配制不同浓度的底数测定同份血清OCT活性, 活性最高者为最适底物浓度。

4.酶促反应连续监测时间 取2份低浓度(1 U/L)和2份高浓度OCT(40 U/L)的血清进行检测, 每16 s读一次A值, 持续10 min, 据其线性计算延迟时间及测定时间。

六、精密度实验

1.批内变异系数(CV) 取低(5 U/L)、中(20 U/L)、高浓度(80 U/L)的血液样本各1份, 重复测定20次, 计算 x̅、s、CV。

2.日间CV 用上述样本(密封4 ℃保存)每日测定2次, 每次间隔2 h以上, 每个样本作双份, 连续测定20 d。

七、回收试验

把OCT含量为20 U/L的血清平均分成3份, 分别加入OCT含量为10、30、80 U/L的血清(按原血清10份, 加入血清1份混合), 用本法双份平行测定。

八、线性实验

取患者高、低值样本各1份, 低值样本OCT浓度为2 U/L, 高值样本OCT浓度为350 U/L, 为病毒性肝炎患者血清与标准品混合而成。低值样本与高值样本按 1:0、3:1、1:1、1:3、0:1 比例混合成 2、89、176、263、350 U/L 5个梯度浓度样本, 每个样本重复测定4次, 取均值为其测定值。

九、稳定性试验

将配制好的试剂分别置于室温、4 ℃及-20 ℃保存, 每日对同一浓度的样本测定1次, 连续检测15 d。

十、参考范围

用本法检测100名体检正常、肝功能正常者血清。

十一、统计学方法

采用SPSS统计学软件分析, 数据用 x̅± s表示, 组间比较采用t检验。

结 果
一、实验条件的选择

1.酶促反应最适pH值和最佳浓度 当磷酸盐缓冲液浓度为0.1 mmol/L、pH值为7.2时酶活性最高。

2.米氏常数(Km)的测定 按Michaelis-Menten方程V=VS /Km +S, 在其他参数固定不变的条件下, 按双倒数法作图法, 得出Y=6.25X + 39.25, Km/v =6.25, 1/v =39.25 mol/min, 即Km=0.16 mmol/L, R2 =0.977, 见图1。

图1 双倒数法作图法求Km

3. 最适底物浓度 瓜氨酸浓度为2.0 mmol/L时血清OCT活性最高, 因此取此浓度为最适底物浓度。

4.酶促反应连续监测时间 根据其线性, 得出延迟时间为60 s, 测定时间为180 s。

二、精密度实验

批内平均CV为3.80%, 日间平均CV为4.08%, 见表1。

表1 精密度实验结果
三、回收试验

回收率分别为93.19% 、91.63% 、89.86%, 平均为91.56%, 见表2。

表2 回收试验测定值
四、线性实验

以△ A/min为纵坐标, 底物浓度为横坐标。线性方程为Y=0.000 1X+0.022 6, R2=0.998 5。OCT 在 320 U/L范围内线性良好, 见图2 。

五、稳定性试验

试剂在室温时可存放3 d; 4 ℃可稳定10 d, -20 ℃ 15 d内未变性, 不可反复冻融。血清一般贮存在4 ℃, 冻融后酶失活。

六、参考范围

100名正常者的血清OCT结果为0~18 U/L, 性别间结果差异无统计学意义(P> 0.05)。其医学决定水平应以临床医生根据实验结果、临床资料及其他检查综合分析为准。

图2 线性试验

讨 论

人体OCT 主要存在于肝脏线粒体, 参与鸟氨酸循环的第二步反应, 催化氨基甲酰磷酸分子上的氨基甲酰基转移到鸟氨酸分子上生成磷酸和瓜氨酸[2]。在肝病及全身其他器官疾病时, 线粒体改变是肝细胞受损的最敏感指标[3]。Plomteux 经肝病谱主要成分分析结论“ OCT是诊断线粒体受损的指标” [4]。OCT在人体内的分布很局限, 几乎只存在于肝脏, 其血清活性升高, 反映肝脏疾病。当肝细胞坏死和病毒性肝炎时, OCT活性显著升高。在阻塞性黄疸、肝硬化、转移性肝癌、心力衰竭(心源性肝损伤)、胆囊炎、肠梗阻的患者, OCT活性轻度升高。OCT活性对肝细胞受损伤反应相当灵敏和具有特异性。OCT和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)同时测定也有助于对心肌病、骨骼肌病等的鉴别诊断。

OCT的检测方法经历了氨终点法、瓜氨酸终点法, 基因特异性抗体聚合酶链反应(ELASA)、纯牛酶ELISA等几个过程。以往终点测定法大多以鸟氨酸为底物, 通过不同的方法, 检测产物的量或通过产物颜色的变化, 间接计算OCT值, 得出的参考值也各不相同[5], 比较经典的方法是瓜氨酸终点比色法, 其反应液pH值为7.0, 正常值范围为0~10 U/L [6], 与国外的资料报道较一致[7]。ELISA虽然灵敏, 但由于成本高、费时费力等因素, 制约了OCT项目的广泛开展, 目前仅用于科研。根据酶学特点, 本研究应用酶偶联反应原理, 在适宜的条件下, 以瓜氨酸为底物, 经过一系列反应, 在自动化分析仪上检测NADH+H+的下降速率, 间接得出OCT活性。该法可以简便、快捷、准确、大批量检测血清样本, 能够作为常规方法在临床上广泛应用, 为临床诊断提供依据。

然而, 由于实验室条件和时间的限制, 对该实验的研究还有所欠缺, 希望今后能完善对该检测方法的进一步研究, 并希望能够与试剂厂家共同努力, 尽早生产出OCT体外诊断试剂盒。将OCT作为常规检测项目, 为临床早期诊断肝细胞损害提供依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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