引用本文
郑立宏, 杨丹, 高晓勤. 精液中一氧化氮含量与精子凋亡关系的初探. 2009, 24(6): 434-437
ZHENG Lihong, YANG Dan, GAO Xiaoqin. Preliminary study of the relationship between the content of nitric oxide and sperm apoptosis in semen. Labratory Medicine, 2009, 24(6): 434-437  
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《检验医学》编辑部
精液中一氧化氮含量与精子凋亡关系的初探
郑立宏1, 杨丹2, 高晓勤3
1.贵阳护理职业学院,贵州 贵阳 550003
2.贵阳医学院外科教研室,贵州 贵阳 550004
3.贵阳医学院教务处,贵州 贵阳 550004

作者简介:郑立宏,女,1980年生,硕士,助教,主要从事男性生殖学研究。

通讯作者:高晓勤,联系电话:0851- 6909610。

基金:贵阳医学院研究生创新基金(S200701); 贵阳市科技局研究生创新基金(T200710)
摘要
目的

研究精液中一氧化氮(NO)含量对精子凋亡的影响及其与男性不育之间的相关性,寻找治疗男性不育的有效途径。

方法

依据世界卫生组织(WHO)标准进行精液常规检测。应用硝酸还原酶法测定不育组和对照组精液中NO的含量。应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的原位末端标记(TUNEL)法检测精子凋亡情况,观察不育组精子凋亡的形态结构改变,统计2组间精子凋亡率。

结果

不育组精液中NO含量[(58.37±14.14)μmol /L]高于对照组[(35.20±8.23) μmol/L]( P<0.01);对照组精子凋亡率为9.67%±2.54%,低于不育组精子凋亡率33.98%±10.54%( P<0.01)。将不育组分为弱精组、少精组和畸形精子组,以畸形精子组NO含量最高,凋亡率也为最高,弱精组及少精组次之。

结论

不育组高浓度NO和精子凋亡率呈正相关,随着NO浓度增高,精子凋亡率增加。精液中高浓度NO可能是男性生育力下降的原因之一。

关键词: 一氧化氮; 精子; 凋亡; 男性不育
中图分类号:Q592 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)06-0434-04
Preliminary study of the relationship between the content of nitric oxide and sperm apoptosis in semen
ZHENG Lihong1, YANG Dan2, GAO Xiaoqin2
1. Guiyang Nursing Vocational College, Guizhou Guiyang 550003, China
2. Department of Surgery, Guiyang Medical College, Guizhou Guiyang 550004, China
3. Dean's Office, Guiyang Medical College, Guizhou Guiyang 550004, China
Abstract
Objective

To research the influence of the level of nitric oxide (NO) on sperm apoptosis and for seeking the effective way to cure male infertility.

Methods

The semen was done routine inspection according to the standard of World Health Organization (WHO). The level of NO in semen in infertile group and control group was determined by nitric oxide reductase. The sperm apoptosis was examined by terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) mediated deoxyuridine triphophate-biotin nick end labeling (TUNEL). The morphosis change of apoptotic sperm in infertile group was observed by microscope; sperm apoptosis rate was counted for both groups.

Results

The level of NO in semen in infertile group [ (58.37±14.14) μmol/L] was higher than that in control group [(35.20±8.23) μmol/L]( P<0.01). The sperm apoptosis rate in semen in control group 9.67%±2.54% was lower than that in infertile group 33.98%±10.54% ( P<0.01). The infertile group was divided into asthenspermia group, oligospermia group and teratospermia group,the level of NO in teratospermia group was the highest and its apoptosis rate was also the highest, and the asthenospermia and oligospermia group were inferior to the teratospermia group.

Conclusions

The high NO concentration in infertile group has a positive correlation with sperm apoptosis rate, which means with NO concentration increases , the sperm apoptosis rate increases. The high NO concentration in semen may be one reason for decreasing male fertility.

Keyword: Nitric oxide; Sperm; Apoptosis; Male infertility

国内外对男性不育症的研究表明, 对男性不育病因的探讨呈现出多样性和复杂性, 有些发病机制尚未完全阐明。育龄夫妇中不能生育的一个重要原因是男性生精障碍。生精细胞凋亡是生精障碍的原因之一。细胞凋亡是细胞在基因控制下有序死亡的方式, 由于其在机体疾病发生发展中的重要作用及治疗上的潜在意义, 已成为生物医学领域研究的热点和前沿之一。精子凋亡现象在生育及不育男性均可见到, 但发生细胞凋亡的比例有所不同。近年来研究发现, 一氧化氮(NO)具有自由基化学性质和多种生物功能[1]。NO作为生物体内一种重要的信息分子和效应分子, 对细胞信息传递、细胞防御、损害和对哺乳动物生殖活动有重要调节作用, 参与精子的发生、成熟和获能等。而体内NO主要由NO合成酶(nitric oxide synthase, NOS) 合成, NOS广泛存在于人类生殖系统各组织, 参与男性生殖系统功能的调节。精液中NO 含量不足或过量, 均可引起精子受精能力下降甚至不育[2~4]。但是, 对于NO对精子功能的影响是何种机制, 虽已做过一些探索, 但尚处于起步阶段。关于不育患者精液中NO含量与精子凋亡是否具有相关性及其与男性不育的关系有待于进一步探讨。

材料和方法
一、材料

1.试剂和设备 NO检测试剂盒由南京生物建成有限公司提供(批号:20070328)。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的原位末端标记(TUNEL)法检测试剂盒及percoll原液由南京凯基生物技术有限公司提供。1× Earle's和10× Earle's液由Sigma公司提供。伟力精子质量检测系统由北京伟力新世纪科技发展有限公司提供。高速冷冻离心机由上海安亭科学仪器厂提供。洁净工作台、恒温恒湿箱、不锈钢鼓风干燥箱均由上海博迅实业有限公司提供。

2.研究对象 (1)对照组:21名, 年龄20~40岁, 由1年内具有生育能力的自愿献精者提供, 均无生殖道疾病、类固醇激素(皮质醇、皮质酮、醛固酮等)的水平异常和因接触放射线等而诱发细胞凋亡的病史; (2)不育组:在贵州医学院附属医院不育门诊就诊的不育患者44例, 年龄20~40岁, 均为已婚同居2年以上, 性生活正常, 夫妻双方均未采取任何避孕措施, 妻子经妇科检查均有生育能力, 无严重躯体性疾病; 排除隐睾症、腮腺炎、内分泌系统疾病, 无接触放射线等因素所致的不育。按世界卫生组织(WHO)标准分为畸形组、少精组、弱精组。

二、方法

1.病史 详细询问与不育有关的疾病史、生殖道感染史、吸烟嗜酒史、有害物质接触史等, 注意患者的体型、发育状况, 检查患者的睾丸、附睾、精索静脉曲张、激素检查等情况。并了解配偶的病史、体格检查及辅助检查情况。

2.精液样本收集及精液常规检查 所有研究对象均禁欲3~5 d, 用新洁尔灭消毒手及尿道口, 以手淫法获取1次全部精液, 放入一次性无菌干燥带盖塑料容器内, 置于37℃恒温恒湿箱中30 min, 待完全液化 。采用伟力彩色精子质量检测系统做精液常规分析。

3.精液样本的制备 按文献[5]中精液样本的制备方法进行。

4.NO含量检测 硝酸还原酶法, 按试剂盒说明书进行。

5.凋亡精子检测 按TUNEL法检测试剂盒说明书操作。采用图像采集分析系统进行观察、拍照。

三、统计学方法

采用SPSS13.0统计软件包进行方差分析和t检验。实验数据以 x̅± s表示。

结 果
一、不育组精液中NO水平为[(58.37± 14.14)μ mol/L], 高于对照组NO水平[(35.20± 8.23)μ mol/L](P< 0.01)。不育组和对照组精液中精子凋亡率分别为33.98%± 10.54%和9.67%± 2.54%, 2组比较差异有统计学意义(P< 0.01), 见表1。
表1 各组NO浓度和精子凋亡率( x̅± s)
二、不育组精液中NO含量与精子凋亡率存在显著正相关[相关系数(r)=0.59, P< 0.01]。见图1。

图1 不育组精液中NO水平与精子凋亡率的关系

三、用TUNEL法检测精液中的凋亡精子。光镜下凋亡精子头部呈棕黄色, 而未凋亡精子头部未被着色, 见图2。

图2 TUNEL法检测精液中的凋亡精子注:箭头表示凋亡精子(LM10× 100)

讨 论

男性不育是困扰许多育龄夫妇的一个世界性问题。引起不育有多种原因, 其中, 已经证实环境因素、内分泌功能失调、睾丸生精功能障碍、输精管道病变、精子结构与功能异常、免疫因素及性功能障碍均可导致不育; 另外, 有相当部分不育原因仍不清楚。在对男性不育研究过程中, 人们发现活性氧是导致男性不育重要因素, NO作为重要活性氧分子备受广大科研工作者关注。

本研究主要是通过体外测定精液中的NO浓度, 因此会受到以下因素的影响, 比如离心时间、水浴温度、比色剂配制的比例、样本不同所需测定的样本量等等。这些必须做到尽可能的精确, 否则实验结果就会有偏差。经过摸索, 掌握好实验条件, 得出了本研究结果:不育组NO含量显著高于对照组(P< 0.01)。对照组精液中NO含量并不影响精子凋亡率, Zhang等[6]研究表明, 适量的NO有利于正常生育者和弱精不育者的精子存活率和运动能力的维持。早在1992年, Stamler等[7]就介绍了NO的重要作用, 其中就包括能促进精子生成和成熟。张玮等[8]通过动物实验证实低浓度NO能抑制精子凋亡。这说明适量NO并不会导致男性生育力下降。本研究根据WHO标准将不育组又划分为少精组、弱精组和畸形组, 3组的NO含量均高于对照组, 并且以畸形组最高, 可能异常增高的NO对精子存在致畸作用。Zini等[9]证实少精子症患者NO水平高于正常组; Weiberg等[10]、Tomlison等[11]研究证实, 弱精子症患者NO水平显著增高; Schmidt等[12] 推测畸形精子症患者中NO水平高于正常生育者的原因可能是在精子分裂的过程中由于NO的影响, 使精子发生畸变, 从而使畸形精子数量增多。此推测在本实验中已得到进一步证实。这说明不育组精液中NO水平显著高于对照组, 并且高水平NO可能会对精子有致畸作用。本研究结果还显示不育组的精子凋亡率显著高于对照组。对不育组精液中NO水平与精子凋亡率进行了相关性分析, 提示两者之间存在显著的正相关(r=0.59, P< 0.01)。随着NO水平异常增高, 精子凋亡率增加。林京等[13]证实外源性NO可诱导弓形虫的速殖子凋亡。张玮等[8]也证实高浓度NO促进精子凋亡率增加。因此高水平NO有可能诱导精子凋亡增加。

另外, 本研究应用TUNEL法检测凋亡精子, 凋亡精子呈棕黄色, 未凋亡精子未着色。TdT介导的TUNEL法是检测凋亡细胞常用的一种方法, DNA裂解为许多单或寡核苷酸片断是细胞凋亡的主要生化标志。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂, 因而很少能够被染色, TUNEL法的优点是脱氧核糖核酸是被直接结合在DNA断链3'-OH末端, 因此是在分子水平上进行的检测; 并且由于DNA断链发生在细胞凋亡的早期阶段, 先于其形态学上的改变, 故在没有出现形态学改变时即可检测出细胞凋亡, TUNEL法能够准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征, 并可检测出极少量凋亡细胞, 灵敏度较高。但在使用时应排除一般的机械性损伤、紫外线等因素的影响。

综上所述, 本研究通过检测不育组和对照组精液中的NO水平和精子凋亡率, 揭示了精液中NO水平异常增高促使精子凋亡增加, 而精子凋亡增加又导致男性生育力下降。因此本研究表明精液中NO水平的异常增高可能是导致男性生育力下降原因之一。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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