引用本文
唐新, 林婴, 黄文芳, 饶绍琴, 张本, 马誓, 刘晓琦, 杨正林, 尹一兵. PPARG基因单核苷酸多态性与2型糖尿病血脂异常的相关性研究. 2009, 24(3): 190-193
TANG Xin, LIN Ying, HUANG Wenfang, RAO ShaoQin, ZHANG Ben, MA Shi, LIU Xiaoqi, YANG Zhenglin, YIN Yibing. The investigation of relationship between PPARG gene single nucleotide polymorphisms and blood lipid abnormality in patients with type 2 diabetic mellitus. Labratory Medicine, 2009, 24(3): 190-193  
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PPARG基因单核苷酸多态性与2型糖尿病血脂异常的相关性研究
唐新1, 林婴2, 黄文芳2, 饶绍琴2, 张本2, 马誓2, 刘晓琦2, 杨正林2, 尹一兵1
1.重庆医科大学医学检验系,重庆市 400016
2.四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室,四川 成都 610072

作者简介:唐 新,女,1977年生,学士,技师,主要从事人类分子生物学与遗传学研究。

通讯作者:尹一兵,联系电话:023-68485658。

基金:国家自然科学基金资助项目(30771219)
摘要
目的

研究PPARG基因单核苷酸多态性(SNPs)与中国汉族2型糖尿病(DM)及血脂异常的关系。

方法

测定593例2型DM患者及626名正常健康者SNPs rs1801282、rs12636454和rs11128597基因型,分析其与2型DM及血脂水平的关系。基因分型采用单碱基延伸法(SBE)。

结果

2型DM组SNPs rs1801282、rs12636454和rs11128597基因型及等位基因频率分布与对照组间差异均无统计学意义( P>0. 05)。2型DM组中rs1801282 AB+BB基因型总胆固醇(TC)、血糖和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著高于AA基因型( P均<0.01)。rs12636454 AA基因型三酰甘油(TG)水平高于AB+BB基因型( P<0.05)。rs11128597 AA基因型血糖水平高于AB+BB基因型( P<0.01)。

结论

PPARG基因与中国汉族人2型DM无直接相关,但可能参与2型DM的血糖水平和脂质代谢的调节。

关键词: PPARG基因; 单核苷酸多态性; 血脂; 2型糖尿病
中图分类号:Q786 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0190-04
The investigation of relationship between PPARG gene single nucleotide polymorphisms and blood lipid abnormality in patients with type 2 diabetic mellitus
TANG Xin1, LIN Ying2, HUANG Wenfang2, RAO ShaoQin2, ZHANG Ben2, MA Shi2, LIU Xiaoqi2, YANG Zhenglin2, YIN Yibing1
1. Department of Laboratory Medicine,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016,China
2. Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene,Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial Peoples' Hospital,Sichuan Chengdu 610072,China
Abstract
Objective

To investigate the relationship between the single nucleotide polymorphisms(SNPs)of eroxisome proliferator-activated receptor-gamma(PPARG)gene and blood lipid abnormality in patients with type 2 diabetic mellitus(DM)in Chinese Han population.

Methods

The SNPs of PPARG gene(rs1801282, rs12636454 and rs11128597)in 593 patients with type 2 DM and 626 healthy controls were determined,and relationship between PPARG gene SNPs and lipid abnormality and patients with type 2 DM SNPs genotyping were performed by a method of Single Base Extension (SBE).

Results

There were not significant differences in genotypes and allele frequency distribution of rs1801282, rs12636454 and rs11128597 between patients with type 2 DM and healthy controls( P>0.05). In type 2 DM patients,the serum levels of total cholesterol(TC), fasting serum glucose(Glu) and low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C) in AB+BB genotypes of rs1801282 were significantly higher than those in AA genotype( P<0.01),the serum level of triglyceride(TG)in AA genotype of rs12636454 was significantly higher than that in AA+AB genotypes( P<0.05),the serum level of Glu in AA genotype of rs11128597 was significantly higher than that in AA+AB genotypes( P<0.01).

Conclusions

The PPARG gene polymorphisms probably has no correlation with the type 2 DM in the Chinese Han population. However,they may participate in the regulation of blood glucose level and lipid metabolism of type 2 DM.

Keyword: PPARG gene; Single nucleotide polymorphism; Blood lipid; Type 2 diabetes mellitus

2型糖尿病(DM)作为1种复杂的慢性代谢紊乱综合症, 遗传倾向明显。针对不同种群, 在已经研究的数十个候选基因中, 仅少数基因与2型DM呈可重复的相关性, 其中PPARG基因可能参与DM及代谢综合症的发生发展[1~3]。PPARG基因定位于3p25, 属于转录因子的核激素受体超家族, 在脂肪细胞的分化、脂肪细胞特异基因的表达和调节胰岛素敏感性方面发挥着重要作用。经大样本荟萃分析显示单核苷酸多态性(SNPs)rs1801282与2型DM易感性相关[4~6]。2型DM患者的高血糖状态与血脂异常的发生密切相关, 2型DM通常在其亚临床期就存在血脂紊乱, 其发病机制与高血糖和胰岛素抵抗相关。其中至少超过半数的患者合并有脂代谢紊乱。我们拟通过研究中国汉族2型DM及糖耐量正常人群的PPARG基因多态性来探讨其SNPs(rs1801282、rs12636454和rs11128597)与2型DM及血脂水平的关系。

材料和方法
一、对象

2型DM组593例, 其中男260例、女333例, 平均年龄60.95± 9.83岁, 来源于四川省人民医院糖尿病专科门诊及住院患者, 依据1997年美国糖尿病协会(ADA)公布的DM诊断标准确诊。正常对照组626名, 其中男244名、女378名, 平均年龄60.76± 9.29岁, 来源于本地区城市社区健康体检者。本研究经四川省医学科学院(四川省人民医院)伦理委员会批准, 全部调查和取样均征得受试者同意并签署知情同意书。病例组与对照组按照年龄和地域分布进行配比, 均来自无亲缘关系的成都地区汉族人群。对全部研究对象进行了标准化的问卷调查, 包括年龄、性别、籍贯、职业、疾病史、病程、吸烟史、家族史、并发症、身高、体重、血压、血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、血脂谱[含总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白等]以及胰岛素、C肽水平等信息。

二、方法

1.生化指标检测 受试者禁食12 h后于清晨采集外周血3 mL, 2 h内分离血浆。已糖激酶法测定血糖水平; 血浆TC、 TG、HDL-C、LDL-C测定采用酶法(北京中生公司试剂)。所有生化指标的检测均在OLYMPLUS AU5400全自动生化分析仪上完成。

2. 基因组DNA提取 抽取2型DM患者及正常对照者外周血5 mL, 使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝, 常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA[7]。紫外分光光度计和0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度后于-20℃保存备用。

3. 聚合酶链反应(PCR) 从基因组数据库网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp& cmd)检索SNPs序列, 引物设计使用Primer Premier 5软件辅助, 并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列见表1。扩增反应采用MyCycler Thermal Cycler扩增仪(美国Bio-Rad公司)。PCR循环条件:95 ℃预变性5 min, 经 (95 ℃ 30 s, 58~60 ℃ 30 s, 72 ℃延伸45 s)× 35个循环, 72 ℃延伸7 min, 4 ℃保温。

表1 PCR扩增引物及检测引物序列

4. PCR产物纯化 在9 μ L PCR产物(各取rs1801282、rs12636454和rs11128597 PCR产物3 μ L)加入1 U 虾碱性磷酸酶(SAP)或小牛血清碱性磷酸酶(CIP)(美国Promega公司)以及1U 限切酶(ExoI, 英国Biolabs公司), 震荡混匀, 37 ℃保温1 h, 然后75 ℃保温15 min以灭活SAP/CIP和ExoI酶。纯化好的模板可以在4 ℃保存24 h或-20 ℃长期保存。

5. SnaPshot○R PCR 取纯化后的产物1 μ L, 分别加入rs1801282、rs12636454和rs11128597的检测引物各0.2 μ L, ABI PRISM○R SnaPshot○R Multiplex 试剂1 μ L(美国ABI公司), 用水补足5 μ L。PCR循环条件:96 ℃预变性1 min, (96 ℃ 10 s, 50 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s)× 25循环, 4 ℃保温。

6. SnaPshot○R PCR产物的纯化 在5 μ L上述SnaPshot○R PCR产物中加入1 U SAP或CIP, 震荡混匀, 37 ℃保温1 h, 75 ℃保温15 min以灭活酶, 4 ℃可保存24 h或-20 ℃长期保存。

7. 电泳样品制备 取上步纯化好的产物1 μ L, 加入Hi-Di Formamide(美国ABI公司)9 μ L, 95 ℃变性 5 min, 迅速冰冷4 min。经ABI 3100 Avant遗传分析仪(美国ABI公司)毛细管电泳法检测荧光信号, 通过不同的荧光检测结果确定检测SNPs位点处碱基的变化, 以确定基因型。

三、统计学方法

将所有完成的问卷统一编码, 使用SPSS Data Entry 2.0 软件建立数据库。群体基因型经Hardy-Weinberg平衡检验。频率比较的单因素分析采用χ 2 检验, 2组之间均数比较用成组t检验, 均运用SPSS13.0软件包进行统计分析。

结 果
一、 PPARG rs1801282、rs12636454和rs11128597基因型及等位基因频率分布

全部样本基因型经Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验, 具有群体代表性(P> 0.05)。PPARG rs1801282、rs12636454和rs11128597的基因型及等位基因频率分布见表2。2组间基因型及等位基因频率的差异无统计学意义(P> 0.05)。

表2 2型DM组和对照组PPARG基因型和等位基因频率分布
二、2型DM组与正常对照组血脂水平

与正常对照组比较, 2型DM组TG和TC水平明显升高(P值均为0.000), HDL-C水平相对升高(P< 0.05), LDL-C水平差异无统计学意义(P> 0.05), 见表3。

三、2型DM组rs1801282、rs12636454和rs11128597不同基因型血糖及血脂水平

rs1801282 AB+BB基因型TC、血糖和LDL-C水平明显高于AA基因型(P均< 0.01)。rs12636454 AA基因型血浆TG水平高于AB+BB基因型(P< 0.05)。rs11128597 AA基因型血糖水平明显高于AB+BB基因型(P< 0.01), 见表4。

表3 2型DM组与对照组血脂水平比较( x̅± s, mmol/L)
表4 2型DM组内不同基因型血脂及血糖水平( x̅± s, mmol/L)
讨 论

2型DM是一种复杂性多基因疾病, 存在着基因-基因、基因-环境间的相互作用, 在遗传和表型方面具有高度异质性。与众多非独立人群2型DM广泛联系的有3个基因的变异体:PPARG基因、 KCNJ11(Kir 6.2)基因和TCF7L2基因。在对多个种族的研究报道的荟萃分析发现PPARG编码外显子上的多态性rs1801282即Pro12Ala(CCA→ GCA)与2型DM或肥胖相关[4~6]。与白种人比较, 中国人群rs1801282的变异率较低, 等位基因C约为97.8%, G仅为2.2%(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=1801282)。因此本研究又选择了另外2个与rs1801282相邻且变异率较高的SNPs, 提示PPARG基因SNPs与中国汉族人群2型DM易感性没有直接相关性(P> 0.05)。在其他人群的研究中也有类似报道[7]。

研究认为DM血脂异常与动脉粥样硬化(AS)呈明显相关, 且提示其在DM人群中发生大血管并发症特别是冠心病起显著作用。近年来对2型DM血脂异常的基础及临床研究均显示, 除了年龄、病程、血糖、血压、肥胖、胰岛素抵抗及环境因素外, 遗传因素也与2型DM患者血脂异常的发生发展密切相关。目前对2型DM的风险因子如肥胖、血脂异常等的分子遗传学研究取得了一定的进展[8]。例如作为2型DM重要的易感基因, LMNA(lamin A/C)基因突变可导致严重胰岛素抵抗和血脂异常综合症[9]; FTO基因通过影响体重指数而诱发DM[10]等。以往研究认为PPARG基因Pro12Ala多态性与血浆脂质和空腹血糖水平相关[11]。在一家族性部份营养不良家系中也发现了PPARG基因的罕见突变[12]。本研究发现在2型DM患者中, rs1801282 AB+BB基因型TC、血糖和LDL-C水平明显高于AA基因型(P均< 0.01)。rs12636454 AA基因型TG水平高于AB+BB基因型(P< 0.05)。rs11128597 AA基因型血糖水平高于AB+BB基因型(P< 0.01)。研究结果进一步提示PPARG基因与血糖水平相关, 而且可能参2型DM血脂紊乱的调节, 为进一步探讨其发病机制提供了重要线索。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Vigouroux C, Fajas L, Khallouf E, et al. Human peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2: genetic mapping, identification of a variant in the coding sequence, and exclusion as the gene responsible for lipoatrophic diabetes[J]. Diabetes, 1998, 47(3): 490-492. [本文引用:1]
[2] Deeb SS, Fajas L, Nemoto M, et al. A Pro12Ala substitution in PPARGamma2 associated with decreased receptor activity, lower body mass index and improved insulin sensitivity[J]. Nat Genet, 1998, 20(3): 284-287. [本文引用:1]
[3] Savage DB, Tan GD, Acerini CL, et al. Human metabolic syndrome resulting from dominant-negative mutations in the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor-gamma[J]. Diabetes, 2003, 52(4): 910-917. [本文引用:1]
[4] Diabetes Genetics Initiative of Broad Institute of Harvard and MIT, Lund University, Novartis Institutes of BioMedical Research, Saxena R, Voight BF, et al. Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels[J]. Science, 2007, 316(5829): 1331-1336. [本文引用:2]
[5] Zeggini E, Weedon MN, Lindgren CM, et al. Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes[J]. Science, 2007, 316(5829): 1336-1341. [本文引用:1]
[6] Scott LJ, Mohlke KL, Bonnycastle LL, et al. A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants[J]. Science, 2007, 316(5829): 1341-1345. [本文引用:2]
[7] Badii R, Bener A, Zirie M, et al. Lack of association between the Pro(12)Ala polymorphism of the PPAR-gamma2 gene and type 2 diabetes mellitus in the Qatari consanguineous population[J]. Acta Diabetol, 2008, 45(1): 15-21. [本文引用:2]
[8] Cauchi S, Nead KT, Choquet H, et al. The genetic susceptibility to type 2 diabetes may be modulated by obesity status: implications for association studies[J]. BMC Med Genet, 2008, 9(1): 45-53. [本文引用:1]
[9] Mesa JL, Loos RJ, Franks PW, et al. Lamin A/C Polymorphisms, Type 2 Diabetes, and the Metabolic Syndrome Case-Control and Quantitative Trait Studies[J]. Diabetes, 2007, 56(3): 884-889. [本文引用:1]
[10] Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN, et al. A Common Variant in the FTO Gene Is Associated with Body Mass Index and Predisposes to Childhood and Adult Obesity[J]. Science, 2007, 316(5826): 889-894. [本文引用:1]
[11] Tai ES, Corella D, Deurenberg-Yap M, et al. Differential effects of the C1431T and Pro12Ala PPARG gene variants on plasma lipids and diabetes risk in an Asian population[J]. J Lipid Res, 2004, 45(4): 674-685. [本文引用:1]
[12] Hegele RA, Cao H, Frankowski C, et al. PPARG F388L, a transactivation-deficient mutant, in familial partial lipodystrophy[J]. Diabetes, 2002, 51(12): 3586-3590. [本文引用:1]