引用本文
罗红权, 陈新敏, 梁家智, 薛峰, 丁显平. 双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征. 2009, 24(3): 186-189
Luo Hongquan, CHEN Xinmin, Liang Jiazhi, Xue Feng, DING Xianping. Detection of Down syndrome by the double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction. Labratory Medicine, 2009, 24(3): 186-189  
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《检验医学》编辑部
双色荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征
罗红权1, 陈新敏2, 梁家智2, 薛峰2, 丁显平1
1. 四川大学生命科学院,四川 成都 610041
2. 四川省妇女儿童医院,四川 成都 610031

作者简介:罗红权,男,1969年生,学士,副主任技师,目前主要从事临床医学检验工作。

通讯作者:丁显平,联系电话:028-87767550。

摘要
目的

建立快速诊断唐氏综合征的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法及其应用于产前诊断唐氏综合征的可能性。

方法

合成21号染色体单拷贝基因DSCR1特异的引物和TaqMan探针以及1对非21号常染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和TaqMan探针,其中检测DSCR1基因的探针标记6-羧基荧光素(FAM),检测GAPDH基因的探针标记六氯(HEX)荧光素;提取患者和正常人外周血及胎儿羊水脱落细胞标本的DNA为模板,在同一PCR扩增管中同时进行2种基因的双色荧光定量聚合酶链反应(the double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction,DC-FQ-PCR),分别定量测定DSCR1基因和GAPDH基因的含量,并计算每个标本2种基因剂量的比值;采用该基因检测技术检测23例唐氏综合征患者、20名正常人和100例羊水,与染色体检查诊断结果对比,判断该技术在唐氏综合征基因诊断和产前诊断中的应用价值。

结果

在30 μL FQ-PCR反应体系中,加入最少约0.05 ng基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;实验表明23例染色体检测为唐氏综合征患者的GAPDH与DSCR1的差值为0.65±0.17, 以2-△CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1.77~1.39。而20例染色体检测为正常人的GAPDH与DSCR1的差值为0.06±0.18,计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1.18~0.92;2组间的差异有统计学意义。在100例羊水细胞的检测中,以DSCR1与GAPDH拷贝数的比值大于1.35为唐氏综合征的判定标准,发现2例为患儿,其余98例为正常,与染色体检查结果一致。

结论

双色荧光定量PCR检测唐氏综合征是一个可行的、快速的、准确的、高通量的、费用较为低廉的检测方法,该法在唐氏综合症的基因诊断和产前基因诊断具有广阔的应用前景。

关键词: 唐氏综合症; DSCR1基因; GAPDH基因; 双色荧光定量PCR
中图分类号:R575.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0186-04
Detection of Down syndrome by the double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction
Luo Hongquan1, CHEN Xinmin2, Liang Jiazhi2, Xue Feng2, DING Xianping1
1. College of life science, Sichuan University, Chengdu 610041, China
2.Sichuan Provicinal Hospital for Women and Children, Chengdu 610031, China
Abstract
Objective

To establish a rapid, convenient, high-throughput method for the detection of Down syndrome (DS), and test the efficiency of the new double chromatography fluorescence quantitative polymerase chain reaction (DC-FQ-PCR) technology for the genetic and prenatal diagnosis of DS.

Methods

The DNAs of peripheral blood lymphocytes from 20 normal persons and 21 DS patients and fetal cell from amniotic fluid of 100 cases of pregnants were extracted. Then DSCR1 and GAPDH gene specific primers and different fluorescent-labeled TaqMan probes were added into the same PCR system to calculate the relative copy numbers of the two genes. The variety of △CTs in normal persons and patients groups and the ratio of DSCR1 and GAPDH copy numbers were calculated. A statistical analysis was carried out to explore their significance. At last, the 100 cases of fetal cell DNA were tested with this method to detect the DS.

Results

We constructed the DC-FQ-PCR successfully for detecting DSCR1 and GAPDH gene dosage. The margin between GAPDH and DSCR1 of DS patients was 0.65±0.17 and the copy number ratio of DSCR1 to GAPDH was 1.77~1.39 approximately by a 2-△CT method; while those of normal persons were 0.06±0.18 and 1.18~0.92. The discrepancy of both△CT and copy number ratio had statistical significance in the two group. Among 100 cases of fetal cell DNA, two cases were detected as DS while other 98 cases were normal by the ratio of copy number of DSCR1 to GAPDH 1.35, and verified by chromosome testing.

Conclusions

The DC-FQ-PCR was a feasible, rapid, accurate, high-throughput and low-cost detection method. this method could be applied to the diagnosis and prenatal diagnosis of DS.

Keyword: Down syndrome; DSCR1 gene; GAPDH gene; fluorescence quantitative polymerase chain reaction

唐氏综合征(Down Syndrome, DS), 又称为先天愚型, 21三体综合征, 是活产胎儿中最常见的染色体异常综合征之一, 其发病率约为1/600~1/800, 是以智力发育迟滞为主要临床特征的优生学重要疾病[1]。其实验室检测的常规方法是首先进行淋巴母细胞或羊水脱落细胞体外培养, 然后制备染色体, 再在显微镜下观察每个核型中21号染色体的数目来确诊。该方法虽然准确度高, 但技术复杂, 耗时长, 不能实现自动化和高通量检测。目前, 我国已经普遍开展了唐氏综合征的产前筛查工作, 这给后续的诊断带来了大量的工作量, 因此探索快速诊断DS的新方法成为研究热点。

由于正常人21号染色体上的单拷贝基因剂量与其他常染色体上的单拷贝基因剂量相同, 而DS患者则是1.5倍[2, 3], DSCR是DS征发病的关键单拷贝区段[4]。因此, 本研究建立双色荧光定量PCR方法, 通过检测DSCR与常染色体单拷贝基因GAPDH的相对拷贝数的比值来判断21号染色体的倍性, 以快速检测唐氏综合征。

材料和方法
一、实验材料

1. 16~20孕周孕妇羊水标本100份, 每份2 mL, 100 000 r/min离心2 min, 弃上清, 冻存于-20℃。23例DS患者外周血和20名正常人外周血, 柠檬酸钠抗凝, 冻存于-20℃。

2. 引物、探针设计合成 根据GenBank中DSCR1(gi:7768679)和GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 三磷酸甘油醛脱氢酶)(gi:32891804)区段序列设计DSCR1及GAPDH特异引物和探针, 其序列如下:DSCR上游引物DF:5'-CAG AAA TCC CAG TTC ATG TTG CT-3', DSCR下游引物DR:5'-CAT TCC CGG GTG CCA TGA ACA GT-3'; DSCR TaqMan探针DTM:5'-(FAM) CAA GGC CGT GTC CCC TTG TTC (TAMRA) -3'; 扩增产物96bp; GAPDH上游引物GF:5'-CTC CCT CTT TCT TTG CAG CAA T-3'; GAPDH下游引物GR:5'-CAG CTC TCA TAC CAT GAG TCC T-3'; GAPDHTaqMan探针GTM:5'-(HEX) CTG CAC CAC CAA CTG CTT AGC (TAMRA)-3', 扩增产物112 bp。

二、实验方法

1. 常规酚-氯仿抽提法提取标本的DNA 正常人基因组1份, 紫外分光光度计测定其DNA浓度, 然后GAPDH和DSCR1基因按12× 105拷贝/μ g基因组DNA计算拷贝数, 并用三羟甲基氨基甲烷(TE)缓冲液稀释成5× 104拷贝/μ L, 5× 103拷贝/μ L, 5× 102拷贝/μ L, 50拷贝/μ L, 10拷贝/μ L, 2.5拷贝/μ L等6个浓度梯度的基因组标准模板系列。

2. 标准曲线制作及扩增体系灵敏度测试 采用上述模板系列, 分别自每个稀释度模板中取样2μ L, 加入总体积30 μ L的反应体系中, 在FTC2000(上海枫岭FUNGLYN)定量PCR仪上行实时荧光定量PCR, 在同一PCR反应管中检测GAPDH和DSCR1的含量。具体步骤如下:分别取上述基因组模板系列DNA 2 μ L, 加入28 μ L PCR反应液(250 μ mol/L dNTP, 10 mmol/L Tris-HCl, pH值8.0, 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.1 g/L明胶, 引物GF、GR、GTM、DF、DR和DTM各0.25 μ mol/L, 1U Taq酶)。在FTC 2000上94℃变性2 min后, 94℃ 20 s、53℃ 20 s、60℃ 1 min, 于60℃时收集荧光, 循环45次, 72℃ 5 min, 观察分析扩增曲线, 读出每一扩增的Ct值。根据荧光变化曲线获得每个反应的Ct值, 从而绘制2个基因的标准曲线。

3. DNA标本各基因Ct值的测定 将各DNA样品各取2 μ L, 加至与上述完全相同的30 μ L反应体系中, 在同样的反应条件下行PCR扩增。测定各样品的GAPDH 和DSCR1基因的Ct值。在PCR反应过程中, 以加TE取代DNA样品的空白管作为阴性对照。

三、统计学方法

应用SPSS10.1 软件包处理, 采用配对t检验进行统计学分析。

结 果
一、各标本荧光定量PCR检测结果分析

GAPDH 和DSCR1标准曲线(图1、图2)显示, 各浓度梯度的DNA标本检测结果拟合的曲线的相关系数为1.0, 说明GAPDH 和DSCR1的定量结果可信, 可以进行定量分析。 对各稀释度的标准模板进行了GAPDH 和DSCR1 2个基因的6个独立的荧光定量PCR反应, 分别获得其扩增曲线及Ct值(表1, 表2), 结果显示, 对于约20个拷贝基因组DNA, GAPDH 和DSCR1 均能获得较稳定的扩增结果。因此通过该荧光定量PCR, 可以在一定浓度范围内有效地检测DSCR1和GAPDH基因的含量。

图1 GAPDH标准曲线

图2 DSCR1标准曲线

表1 各种稀释度DNA的GAPDH PCR扩增结果
表2 各种稀释度DNA的DSCR PCR扩增的Ct值
二、 正常人和DS患者外周血DNA检测结果

在20名正常人外周血DNA的FQ-PCR检测中, 20名(100%)GAPDH扩增阳性, 其Ct值范围在20.6~22.3之间; 有20名(100%)DSCR1阳性, 其Ct值范围在20.5~22.4; 经计算, GAPDH与DSCR1的差值为0.06± 0.18范围, 以2-△ CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1.18~0.92。

在23例临床DS患者外周血DNA的FQ-PCR检测中, 23例(100%)GAPDH扩增阳性, 其Ct值范围在20.3~22.5之间; 有23例(100%)DSCR1阳性, 其Ct值范围在19.6~21.9; 经计算, GAPDH与DSCR1的差值为0.65± 0.17范围, 以2-△ CT方法计算DSCR1与GAPDH拷贝数的比值范围为1.77~1.39。

在100例羊水细胞DNA的FQ-PCR的检测中, GAPDH和DSCR1扩增均为阳性, 其Ct值范围在21.2~27.5之间; DSCR1与GAPDH拷贝数的比值大于1.35为唐氏综合征的判定标准, 发现2例为患儿(1例为1.62, 1例为1.52), 其余98例(均小于1.35)为正常, 与染色体结果一致。

讨 论

产前筛查和产前诊断是降低重大出生缺陷的有效办法。目前DS的产前筛查和产前诊断在我国开展较为普遍, 在优生工作和重大出生缺陷干预工程中占有重要地位。但由于目前DS的实验室产前诊断方法采用的是羊水染色体培养, 耗时长, 效率低, 不能高通量进行, 导致大量病员流失。有研究报道利用检侧基因多态性产前诊断DS, 即利用PCR技术, 将扩增产物荧光染色、银染或者32P同位素标记, 半定量检测21号染色体特异基因片断的条带数和条带染色的相对强度来推测21号染色体为三体或二体[7, 8]。通常此方法使用2~3个短串联重复序列, 但会有少数这类基因的纯合子不能做出明确诊断。荧光定量PCR方法是根据PCR反应指数增长特性, 通过寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系, 对靶DNA的拷贝数进行精确定量的技术方法[4]。该方法快速、灵敏、高通量且不用开盖检测PCR产物, 避免了PCR易发生污染的问题。因DS患者21号染色体的基因剂量较正常人多1/2, 其上的单拷贝基因的剂量较其他常染色体上单拷贝基因剂量也多1/2, 因此, 可以通过检测同一标本的21号染色体特异的单拷贝基因和其他常染色体单拷贝基因的基因剂量, 计算二者比例关系, 判断是否为DS。近年来已有应用荧光定量PCR诊断DS研究报道, 显示出很好的应用前景[9, 10]。我们的研究显示, 通过DC-FQ-PCR检测, DS患者外周血DNA的DSCR1与GAPDH基因剂量比值范围为1.77~1.39, 显著高于正常人外周血DNA的1.18~0.92, 且二者没有重叠区, 提示通过精确定量检测DSCR1与GAPDH基因剂量是可以快速精确诊断DS。应用DSCR1与GAPDH基因剂量比值为1.35分界线, 在100例羊水的DS试验性检测中, 诊断出2例DS患儿, 并得到染色体检查的证实, 提示我们建立的DC-FQ-PCR在产前诊断DS中具有广阔的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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