引用本文
罗丹, 鄢盛恺, 程歆琦, 宋耀虹. 同型半胱氨酸及胱硫醚β-合成酶基因多态性与2型糖尿病合并冠心病的关系. 2009, 24(3): 182-185
Luo Dan, Yan Shengkai, Cheng Xinqi, Song Yaohong. Homocysteine and prevalence of polymorphism of CBS 844ins68 in type 2 diabetes mellitus patients with coronary heart disease. Labratory Medicine, 2009, 24(3): 182-185  
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同型半胱氨酸及胱硫醚β-合成酶基因多态性与2型糖尿病合并冠心病的关系
罗丹1, 鄢盛恺2, 程歆琦3, 宋耀虹3
1. 空军总医院临床检验中心,北京100036
2. 中日友好医院,北京 100029
3. 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科,北京100730

作者简介:罗 丹,女,1974年生,硕士,主治医师,主要从事临床生化及基础研究。

通讯作者:鄢盛恺,联系电话:010-84205213。

摘要
目的

探讨我国北方汉族糖尿病(DM)合并冠心病(CHD)者同型半胱氨酸水平(Hcy)及Hcy代谢相关酶胱硫醚β-合成酶(CBS)的844ins68的基因多态性特点。

方法

检测104例2型DM合并CHD患者(DM合并CHD)、127例2型DM患者、61例CHD患者和91名健康对照者的Hcy、叶酸、维生素B12、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A-I(apo A-I)、载脂蛋白B(apo B)浓度。应用聚合酶链反应(PCR)分析CBS 844ins68基因多态性。

结果

DM合并CHD组Hcy水平明显高于DM组和对照组,叶酸、维生素B12水平明显低于DM组及对照组( P<0.01)。DM合并CHD组与CHD组Hcy、叶酸、维生素B12水平差异无统计学意义 ( P>0.05)。DM组与对照组之间Hcy、叶酸、维生素B12水平差异无统计学意义 ( P>0.05)。4组CBS 844ins68的基因型及等位基因频率差异均无统计学意义( P>0.05)。Logistic回归分析显示高Hcy水平、年龄、TC是CHD发生的独立危险因素,OR值[95%可信区间(CI)]分别为2.117(1.081~4.145)、1.105(1.070~1.142),1.023(1.005~1.042)( P均<0.05)。CBS 844ins68的OR值(95%CI)为1.254(0.229~6.867)( P>0.05)。

结论

高Hcy水平是我国北方汉族人2型DM合并CHD发生的独立危险因素。CBS 844ins68基因多态性不是2型DM合并CHD的危险因素。

关键词: 同型半胱氨酸; 胱硫醚β-合成酶; 基因多态性; 糖尿病; 冠心病
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0182-04
Homocysteine and prevalence of polymorphism of CBS 844ins68 in type 2 diabetes mellitus patients with coronary heart disease
Luo Dan1, Yan Shengkai2, Cheng Xinqi3, Song Yaohong3
1. lenter of Chinical Laboratory, General Hospital of Air Force, Beijing 100036, China
2. China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China
3. Department of Clinical Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730, China
Abstract
Objective

To explore the significance of the levels of homocysteine (Hcy) and the gene polymorphisms of cystathionine β-synthase (CBS) 844ins68 in type 2 diabetes mellitus(DM) with coronary heart disease(CHD) in Han nationality from Northern China.

Methods

The levels of plasma Hcy, folate, vitamin B12, total cholesterol(TC), triglyeride(TG), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C), apolipoprotein A-I(apo A-I) and apolipoprotein B (apo B) in 104 patients with type 2 DM and CHD, 127 patients with type 2 DM, 61 patients with CHD and 91 controls were determined. The gene polymorphisms of the CBS 844ins68 was determined by polymerase chain reaction (PCR)-based assay.

Results

The plasma Hcy levels in DM with CHD patients were significantly higher than in control group and DM patients, and the levels of plasma folate and Vitamin B12 were significantly lower than in control group and DM patients ( P<0.05). The levels of Hcy, folate and Vitamin B12 in DM with CHD patients had not significant differences than those in CHD group( P>0.05). The levels of Hcy, folate and Vitamin B12 between in DM patients had not significant differences than those in control groups. There was no significant difference in the frequencies of CBS 844ins68 genotype and allele among 4 groups ( P>0.05). Logistic-regression analysis indicated that hyperhomocysteinemia(HHcy), age, TC were the independent risk factors for CHD in type 2 diabetes, and OR [95% confidence interval (CI)] were 2.117(1.081-4.145), 1.105(1.070-1.142),1.023(1.005-1.042)( P<0.05), respectively. The OR(95%CI) of CBS 844ins68 was 1.254(0.229-6.867)( P>0.05).

Conclusions

HHcy was the independent risk factor for DM with CHD, and the gene polymorphism of CBS 844ins68 was not the risk factor for DM and CHD in northern Chinese Han population.

Keyword: Homocysteine; Cystathionine β- synthase; Gene polymorphism; Diabetes mellitus; Coronary heart disease

2型糖尿病(DM)合并冠心病(CHD)(简称DM合并CHD)是2型DM患者(简称DM)主要死亡原因之一。血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平升高是动脉硬化性血管疾病(如CHD、脑卒中和进行性周围血管病)的独立危险因素, 可用于预测心脑血管事件发生的危险性。国内外对DM、DM合并CHD患者的Hcy水平研究结果不一致, 尚未见关于DM合并CHD患者Hcy代谢相关酶胱硫醚β -合成酶(CBS) 844ins68基因多态性的报道。我们检测了DM合并CHD、DM与CHD患者的Hcy、叶酸、维生素B12、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A-I(apo A-I)、载脂蛋白B(apo B)、CBS 844ins68基因多态性, 探讨Hcy水平及CBS 844ins68基因多态性与DM合并CHD的关系。

材料和方法
一、研究对象

本研究共纳入383名研究对象, 其中DM合并CHD 组104例, 均为北京协和医院心内科因CHD住院的单纯2型DM患者, 男62例, 女42例, 年龄33~83岁; DM组127例, 选取在最近一年之内新近诊断为单纯2型DM的患者, 男68例, 女59例, 年龄34~72岁; CHD组61例, 经冠状动脉造影证实为CHD者, 男32例, 女29例, 年龄36~83岁; 选取91名正常健康人作为正常对照组, 男43名, 女48名, 年龄39 ~82岁。所有以上研究对象均为我国无血缘关系的北方汉族人。

二、方法

1.样本采集及检测 禁食12~14h后清晨空腹采肘静脉血。一管3 mL, 以乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝, 抽血后立即置于冰浴中, 离心分离, 血浆-20 ℃ 冻存用于检测Hcy、叶酸、维生素B12; 白细胞层供提取基因组DNA。另一管5 mL, 无抗凝剂, 分离血清, -20 ℃冻存待测TC、TG、HDL-C 、LDL-C、apo A-I、apo B。Hcy测定采用荧光偏振免疫法(fluorescence polarization immunoassay, FPIA), 叶酸、维生素B12测定采用微粒子酶免分析(microparticle enzyme immunoassay, MEIA)。

2.CBS 844ins68多态性检测 采用根据鄢盛恺等[1]建立的改良NaI法提取基因组DNA。检测每位受试者的CBS 844ins68位点的基因多态性。根据文献[2]设计下列引物, 正义链:5'-CTG GCCTTGAGCCCTGAA-3'; 反义链: 5'-GGC CGGGCTCTGGACTC-3'。扩增体系包括:引物0.4 μ mol/L、dNTP 200 μ mol/L、10× buffer 5 μ L、MgCl2 1.0 mmol/L、Taq酶2.5 U、基因组DNA 0.2 μ g、总体积 50 μ L。反应体系循环条件为94 ℃预变性5 min, 再进行以下循环:94 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min, 循环35次, 72 ℃延伸5 min。聚合酶链反应(PCR)产物直接进行电泳检测。

三、统计学方法

统计学分析采用SPSS10.0软件进行分析。Hcy、叶酸、维生素B12为偏态资料对数转换后为正态, 本研究中三者所有统计学检验的P值均为对数转换后的P值, 三者数据均以中位数(范围)表示。4组正态性的计量资料的比较采用ANOVA, 基因频率及等位基因频率比较采用χ 2检验, 多因素分析采用Logistic 回归分析。

结 果
一、4组Hcy、叶酸、维生素B12结果

DM合并CHD组Hcy明显高于DM组及正常对照组(P< 0.01), 叶酸、维生素B12明显低于这2组(P< 0.01)。DM合并CHD组Hcy、叶酸、维生素B12与CHD组比较差异无统计学意义(P> 0.05), DM组与对照组之间Hcy、叶酸、维生素B12差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 4组人群Hcy、叶酸、维生素B12水平
二、CBS 844ins68基因型鉴定

CBS基因PCR扩增产物目的长度为184 bp。存在CBS 844ins68突变者可扩增出252 bp DNA片段。CBS基因扩增结果见图1。

图1 CBS 844ins68扩增后不同基因型电泳结果

三、4组CBS 844ins68基因型及等位基因频率分布

4组基因型频率及等位基因频率之间差异均无统计学意义(P均> 0.05)。4组均未发现纯合突变, 且杂合频率均较低。对照组CBS 844ins68杂合频率为6.6%, DM合并CHD组为2%, DM组为3.2%, CHD组为4.9%。见表2。不同组别不同基因型的浓度比较存在统计学差异, 由于各组杂合基因型例数太少, 基因型浓度结果供参考, 见表3。

四、DM合并CHD危险因素的Logistic回归分析

将所有4组受试者作为整体进行多元Logistic回归分析。本研究定义:Hcy> 15 μ mol/L为高Hcy。以是否患有DM合并CHD为因变量Y(1=是, 0=否); 以高Hcy、性别、年龄、叶酸、维生素B12、TC、TG、HDL-C、LDL-C、apo A-I、apo B、及CBS 844ins68为自变量。最后入选高Hcy、年龄、TC可能是冠心病发生的独立危险因素, 优势比(OR)值[95%可信区间(CI)]分别为2.117(1.081~4.145)、1.105(1.070~1.142), 1.023(1.005~1.042)(P均< 0.05)。CBS 844ins68的OR值(95%CI)为1.254(0.229~6.867)(P=0.795)。其他变量均非危险因素(P均> 0.05)。

表2 4组CBS 844ins68基因型及等位基因频率分布
表3 4组CBS 844ins68不同基因型Hcy水平(μ mol/L)
讨 论

本研究中DM合并CHD组Hcy水平明显高于DM组及正常对照组, 与CHD组差异无统计学意义。国内外对Hcy与DM合并CHD之间的关系报道不完全一致。Araki等[3]研究得出高Hcy与DM大血管病变独立相关, 可能是日本DM患者合并CHD发生、发展的重要因素之一。然而Al-Nozah等[4]报道在沙特阿拉伯, Hcy与DM合并CHD无关。

Soinio等[5]对2型DM患者随访7年发现Hcy> 15 μ mol/L者比< 15 μ mol/L者发生CHD死亡的危险性高, 分别为26.1%和13.5%(P=0.005); 2组CHD事件发生危险性分别为36.2%和22.6%(P=0.011)。Cox回归分析表明血浆Hcy与CHD致死率(P=0.001)及CHD发生率(P=0.002)密切相关。Becker 等[6]对DM患者和非DM对照者10年随访研究得到: DM组Hcy每增加5 μ mol/L, CHD危险性增加28%(OR值为1.28, 95%CI为1.02~1.58); 非DM组Hcy与增加冠状动脉事件危险性无关(OR值为0.86, 95%CI为0.52~1.41)。由此可见, 大多数研究包括病例对照研究以及随访研究都表明高Hcy可以增加DM合并CHD的危险性。一些研究显示Hcy与DM合并CHD无关, 可能与研究例数、患者选择、地区、种族或生活方式等有关。

高Hcy引起DM合并CHD的可能机制为氧化损伤、凝血系统紊乱、脂质过氧化、促进血管平滑肌增殖、可使血管内皮暴露于糖基化终末产物引起内皮损伤, 与糖基化终末产物有协同作用等[7, 8]。

CBS是Hcy转硫基代谢途径的限速酶。最早发现此多态性是Sebastio等[9]学者, 他们在1995年一个由于CBS缺陷导致Hcy尿患者中发现同时存在T833C纯合突变及844位68 bp插入杂合子, 对维生素B6治疗有效。作者推测由于插入产生了提前终止的密码子, 由此产生缩短的蛋白质是无功能的。Tsai等[2]报道在美国正常人中杂合子较常见, 频率约为11.7%, 与前面结论相反, 68 bp插入并没有导致Hcy血症。本研究中4组两两之间基因型频率及等位基因频率的差异均无统计学意义。4组杂合频率均较低, 且均未发现纯合突变。本研究杂合频率较低与国外报道不一致, 有可能与地域、种族差异有关。由于杂合频率较低, 不同组基因型浓度比较, 结果有一定局限性。本研究关于CBS 844ins68与DM合并CHD无关的结论, 需要增加研究例数, 有待进一步证实。

研究中合并组患者叶酸、维生素B12明显低于对照组和DM组。二者缺乏可能是造成Hcy代谢异常的重要营养因素。有研究发现叶酸和维生素联合补充最好。除药物干预外, 应劝患者改变生活方式, 多食用含有叶酸的食物, 减少动物蛋白摄入量, 降低咖啡消耗, 戒烟, 增加体育锻炼。

本研究证明高Hcy是我国北方汉族人DM合并CHD的独立危险因素。检测Hcy水平可能有助于发现易感人群。尽早补充叶酸、维生素能否降低Hcy水平, 甚至能否减少DM合并CHD发生的危险性, 需在大量临床实践中进行进一步验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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