引用本文
蒋华, 陈建红, 王卫东, 杭霞, 张荣良, 姜昊文, 丁强. 重组PEDF腺病毒载体的构建及其抗膀胱癌效应的研究. 2009, 24(3): 169-172
JIANG Hua, CHEN Jianhong, ZHANG Weidong, WANG Xia, WANG Ronliang, JIANG Haowen, DING Qiang. Construction of PEDF adenovirus and its therapeutic effect on bladder tumor. Labratory Medicine, 2009, 24(3): 169-172  
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《检验医学》编辑部
重组PEDF腺病毒载体的构建及其抗膀胱癌效应的研究
蒋华1, 陈建红1, 王卫东1, 杭霞1, 张荣良1, 姜昊文2, 丁强2
1.南通大学附属丹阳医院泌尿外科 江苏丹阳 212300
2.复旦大学附属华山医院泌尿外科 上海 200040

作者简介:蒋 华,男,1972年生,主治医师,主要从事泌尿系肿瘤的诊治工作。

摘要
目的

利用腺病毒载体系统构建视网膜色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)的重组腺病毒载体,并观察其对膀胱癌细胞J82 的杀伤作用。

方法

将PEDF cDNA 克隆入pENTR-TOPO中,通过同源重组接入腺病毒载体,用脂质体转染入人胚肾293细胞中,包装获得重组腺病毒Ad-PEDF。将重组腺病毒颗粒体外感染J82细胞后,检测细胞活力和细胞凋亡,并在软琼脂中测定克隆形成能力。将感染装有PEDF 基因的病毒的J82细胞注入裸鼠皮下,观察PEDF 的抑瘤能力。

结果

免疫印迹法(Western blot)证实感染PEDF 腺病毒的J82细胞中有PEDF 蛋白的正确表达。将重组腺病毒颗粒体外感染J82,能以剂量依赖的方式抑制细胞活力;流式细胞术检测凋亡细胞明显多于对照组;软琼脂试验显示感染PEDF后能抑制克隆的形成。 感染PEDF腺病毒的膀胱癌细胞在裸鼠皮下形成的种植瘤的体积与感染对照病毒的种植瘤相比有显著减小。

结论

PEDF 能抑制膀胱癌细胞的生长,具有潜在的治疗作用。

关键词: 视网膜色素上皮衍生因子; 膀胱癌; 腺病毒
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)03-0169-04
Construction of PEDF adenovirus and its therapeutic effect on bladder tumor
JIANG Hua1, CHEN Jianhong1, ZHANG Weidong1, WANG Xia1, WANG Ronliang1, JIANG Haowen2, DING Qiang2
1. Department of Urology, Danyang Hospital, Nantong University, Jiangsu 212300, China
2. Department of Urology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
Abstract
Objective

To construct adenovirus vector containing PEDF cDNA and evaluate the therapeutic effect on bladder tumor J82 cells.

Methods

The full length cDNA of PEDF was cloned to pENTR-TOPO and was introduced to adenovirus vector by homologous recombination. This vector was transfected into 293A cells with lipofectamine 2000 to produce a replication-incompetent adenovirus Ad-PEDF. Bladder cancer J82 cells were infected with Ad-PEDF, cell viability, apoptosis and growth in soft agar were checked. Tumorigenicity was examined in vivo by subcutaneous xenotransplantation into rude mice.

Results

J82 showed high levels protein as verified by Western blot after the transduction of Ad-PEDF. Ad-PEDF treatment inhibited cell growth in a dose-dependent manner. Ad-PEDF treatment induced more cell apoptosis compared with the control group. Treatment with Ad-PEDF also inhibited the ability of these cells to form colonies and grow in soft agar. Treatment of nude mice carrying xenograft tumors with PEDF resulted in a significant reduction in growth rates compared with LacZ-treated tumors (control).

Conclusions

Our findings demonstrate that PEDF reduces proliferation and has the therapeutic effect on human bladder carcinoma.

Keyword: PEDF; Bladder carcinoma; Adenovirus

视网膜色素上皮细胞衍生因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)是一种具有神经营养、细胞分化、抑制血管生成作用的多功能蛋白[1]。PEDF这种天然的高效的新生血管抑制剂和肿瘤的关系及其用于肿瘤治疗的潜在可能性也引起了学者的的广泛关注。Crawford 等[2]发现PEDF在神经母细胞瘤中既对肿瘤细胞具有分化调控的作用, 又是主要的抗血管生成的抑制剂。PEDF高表达可以减缓胶质瘤[3]、骨肉瘤[4]、前列腺癌[5]等肿瘤的生长和侵袭, 我们先前的研究发现在高达76.6%的膀胱癌组织中PEDF mRNA表达缺失, 且PEDF下调与肿瘤恶性分期显著相关[6], 这些研究显示PEDF可能对膀胱癌也具有一定的良性作用。本实验利用复制缺陷型腺病毒作为PEDF 基因的载体构建PEDF腺病毒, 体外感染膀胱癌肿瘤细胞J82, 证明PEDF 能通过诱导肿瘤细胞的凋亡而杀伤肿瘤细胞, 为下一步PEDF 基因治疗膀胱癌及关于PEDF 的基础研究提供良好的实验基础。

材料和方法
一、PEDF腺病毒的制备

1. PEDF重组腺病毒载体的构建 将PEDF cDNA 连接到 pENTR-TOPO (美国Invitrogen)载体上, 按试剂盒说明, 将pENTR-TOPO、腺病毒载体pAd/CMV/V5-PEDF及相关反应成分混合, 完成体外同源重组。并转化感受态细胞TOP 10后, 氨苄青霉素筛选同源重组阳性克隆, 并经测序鉴定。同源重组体命名为pAd-PEDF。同样方法构建对照空病毒载体 pAd-LacZ。按试剂盒说明大量制备重组腺病毒质粒备用。

2. 重组腺病毒的制备、滴度测定及鉴定 将鉴定正确的病毒质粒用PacⅠ 充分消化后, 用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen)转染入人胚肾293细胞, 细胞转染2周后, 收集细胞, 经3次反复冻融后, 7 000 r/min离心15 min, 小心吸出上清, -80℃保存。包装后的腺病毒(Ad-PEDF) 用空斑法测定滴度, 操作按ViraPower Adenovirus Expression System试剂盒说明书进行。

二、方法

1. 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞存活率 将10、20、50和100 MOI Ad-PEDF 和Ad-LacZ分别感染 J82 4 h后, 继续培养48 h。在96孔板上每孔接种5× 103个细胞, 每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μ L, 继续孵育4 h, 终止培养。小心吸弃上清液, 每孔加入150 μ L二甲基亚砜(DMSO), 震荡10 min, 选择570 nm波长, 在自动酶联检测仪上测定各孔光吸收值(A), 重复实验3次。

2. 软琼脂集落生长实验 在6孔板中每孔加2 mL 1: 1混合的1.2% 低溶点琼脂糖和含20%胎牛血清的2× RPMI 1640培养基, 室温30 min凝固。加J82细胞悬液于1: 1混合0.7%低溶点琼脂糖和含20%小牛血清的2× RPMI 1640培养基中, 细胞终浓度为1× 104, 滴入已铺有底层胶的6孔板中, 每孔加1 mL。每种细胞制备3个复孔, 置37℃ CO2培养箱培养3周, 相差显微镜计数细胞集落, 实验重复3次。

3. 凋亡试验 分别取50 MOI(滴定单位)的Ad-PEDF和Ad-LacZ感染 J82 4h后, 分别收1× 106个细胞, 用冷的PBS洗2次, 加1× binding buffer制成1× 106/mL的悬液, 取200μ L, 加AnnexinV-FITC 5μ L, 4 ℃避光放置30 min, PBS洗3次, 加10 μ L(20 μ g / mL)PI, 用流式细胞仪(美国BD)分析。每样本收集1× 104个细胞荧光信号, 采用Cell quest 软件分析结果。

4. 抑瘤试验 将J82膀胱癌细胞于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养, 在长至60%的饱和度时分别感染Ad-PEDF和Ad-LacZ 后, 收集细胞悬浮于PBS中备用。裸鼠随机分为2组, 每组6 只, 试验组每只大鼠在大鼠左下腹部皮下接种感染Ad-PEDF 后的J82细胞 1× 107, 对照组每只大鼠在大鼠左下腹部皮下接种感染Ad-LacZ 后的J82细胞 1× 107。每周观察皮下移植瘤的生长情况, 计算肿瘤体积(体积=长径× 短径2× 0.5)。

结 果
一、Ad-PEDF的制备、滴度测定和目的蛋白的表达

病毒滴度经测定为1× 1011 pfu/mL。Western印迹检测证实在J82未检测出PEDF 表达, 感染Ad-PEDF 的J82细胞中有大量的PEDF 蛋白的表达, 且表达强度与病毒滴度呈正比。感染Ad-LacZ的J82细胞没有目的蛋白的表达(图1)。

图1 Western Blot检测Ad-PEDF感染J82后PEDF的表达

二、PEDF 对人膀胱癌细胞系J82增殖作用的影响

将不同滴度(10、20、50、100 MOI)的病毒感染J82 4h, 继续培养 48 h 后, MTT 实验检测PEDF对人膀胱癌细胞系J82 增殖作用的影响结果见图2。当Ad-PEDF 滴度为10、20 MOI 时, 与对照组相比, 细胞未显示明显抑制; 当Ad-PEDF 滴度为50、100 MOI 时, 细胞活力分别对照细胞的83%、64%(图2)。

图2 不同滴度(10、20、50、100 MOI)的病毒感染后的J82细胞活力

三、PEDF诱导对人J82 细胞周期的凋亡

J82 细胞经50 MOI Ad-PEDF感染后, 细胞凋亡率明显高于Ad-LacZ 感染组细胞和PBS处理组细胞。PBS 处理细胞组细胞平均凋亡率为9.36%, Ad-LacZ 感染组细胞平均凋亡率为8.75%, Ad-PEDF 感染组细胞平均细胞凋亡率为22.73%, Ad-PEDF 感染组平均细胞凋亡率显著高于PBS 处理细胞组和Ad-LacZ 感染组(P< 0.01)。

四、PEDF的表达对细胞集落形成的影响

Ad-PEDF 和Ad-LacZ 感染 J82 后, Ad-LacZ 感染细胞组和Ad-PEDF感染细胞组平均在每个培养孔上形成的克隆数(直径大于 0.1 mm)分别为 64、27, Ad-PEDF感染组形成的克隆数明显小于Ad-LacZ 感染组, 而且细胞形成的克隆大小较其他2组明显减小(图3)。

图3 将 Ad-PEDF 和Ad-LacZ 感染 J82后, 用软琼脂生长实验检测集落形成能力

五、PEDF 对裸鼠内种植瘤生长的影响

Ad-PEDF 组肿瘤生长明显受到抑制, 植入体内35 d后, 平均瘤体大小为684 mm3, 显著低于Ad-LacZ组的1 110 mm3和PBS 对照组的1 243 mm3, 肿瘤抑制率达61.6%, 而后2组之间差异无统计学意义。

讨 论

在肿瘤的基因治疗中, 腺病毒载体因其具有宿主范围广泛, 即可感染分裂细胞也可感染非分裂细胞, 转染效率高, 表达时间长, 没有致癌和致突变的危险等优点, 在基因治疗的研究中被广泛应用[7]。

PEDF是1989年Tombran-Tink等[8]在胎儿视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelial, RPE)条件培养基诱导视网膜母细胞瘤细胞神经元分化的实验中, 发现的一种新的神经活性因子。后续的研究陆续发现PEDF不仅可以通过抑制血管生成, 而且可以直接抑制肿瘤细胞, 从而从2条途径抑制肿瘤的生成。

我们先前检测了膀胱癌中PEDF 表达, 发现30例肿瘤组织中有23例(76.6%)检测到PEDF表达下调, 而10例正常组织只有1例(10%)。 本研究在原来基础上, 将PEDF 基因通过腺病毒转入不表达PEDF的膀胱癌细胞 J82, 观察PEDF 基因对癌细胞增殖、侵袭的作用。本研究采用 Gateway 技术成功研制了携有PEDF 基因的腺病毒, 当Ad-PEDF 滴度为50、100 MOI 时, 能显著降低细胞的增殖活力, 为了搞清PEDF 是否通过细胞的凋亡来降低细胞的活力, 我们采用了流式细胞仪和 Annexin-V 和PI 双染技术来检测感染细胞的凋亡, 结果显示转入PEDF 基因后凋亡细胞出现明显的增多, 我们在实验中也检测了PEDF 对侵袭性的影响。我们采用软琼脂法检测克隆形成能力, 发现PEDF 能极大地减少克隆数, 体内试验也显示PEDF 能减低体内肿瘤细胞的生长。

我们的结果与Guan等[5]的结果相似, 他发现PEDF对前列腺癌细胞的生长有直接的抑制作用, 并通过caspase-3介导细胞凋亡, 并通过与细胞生长和迁徙密切相关的信号调节通路来进行。无独有偶, Takenaka等[9]也报道了PEDF可在体外抑制骨肉瘤细胞MG63 的增殖和DNA 合成。这些研究提示PEDF 可能通过调节一系列细胞因子从而发挥其抗肿瘤转移功能。

膀胱癌在我国的发病率逐年上升, 对于复发、转移的晚期膀胱癌, 尚缺乏有效的治疗手段, 发展新的治疗方法— — 基因治疗已经成为候选手段之一, 鉴于PEDF 对肿瘤细胞的特异性抑制作用, PEDF 已经成为生物治疗的靶基因之一, 我们的研究为下一步研究PEDF 的基因治疗膀胱癌奠定了实验基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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