引用本文
康向东, 马艳春, 张隆, 吴蓉, 华蕾. 抗人甲状腺球蛋白人源化单克隆抗体的制备. 2009, 24(2): 97-100
KANG Xiangdong, MA Yanchun, ZHANG Long, WU Rong, HUA Lei. Preparation of the humanized anti-human thyroglobulin monoclonal antibodies. Labratory Medicine, 2009, 24(2): 97-100  
Permissions
Copyright©2009, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
抗人甲状腺球蛋白人源化单克隆抗体的制备
康向东, 马艳春, 张隆, 吴蓉, 华蕾
上海中医药大学附属普陀医院,上海 200062

作者简介:康向东,男,1959年生,博士,主任技师,主要从事肿瘤、单抗、自身免疫病病因及发病机制研究。

基金:国家自然科学基金资助项目(30570521)
摘要
目的

获得抗人甲状腺球蛋白(hTg)人源化单克隆抗体。

方法

从分泌抗人甲状腺球蛋白的杂交瘤细胞株hTg-60中提取总RNA,逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)扩增出鼠源性单克隆抗体hTg-60的VH及VL基因,经基因测序分析,设计出人源化抗体的基因引物,获得抗Tg单克隆抗体人源化VH及VL基因并将其克隆入真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),表达人源化抗hTg抗体。

结果

成功获得了6株能稳定分泌抗hTg人源化抗体的细胞株。

结论

为进一步获得人源化的hTg抗体及临床应用奠定了基础。

关键词: 甲状腺球蛋白; 人源化抗体; 单克隆抗体
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)02-0097-04
Preparation of the humanized anti-human thyroglobulin monoclonal antibodies
KANG Xiangdong, MA Yanchun, ZHANG Long, WU Rong, HUA Lei
Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200062,China
Abstract
Objective

To obtain the humanized monoclonal antibody against human thyroglobulin (hTg).

Methods

Total RNA was isolated by trizol from hTg hybridoma cells which secreted antibody against hTg. The total RNA was used to amplify the VH and VL genes by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The resultant VH and VL genes were applied as a template for amplification of humanized VH and VL genes by PCR. The humanized gene was cloned into the eukaryotic expression vector. The plasmid was transfected into Chinese hamster ovary cells(CHO) to obtain humanized monoclonal antibody.

Results

The six strains cells secreting humanized monoclonal antibodies against hTg were successfully constructed.

Conclusions

The study provides the basis for the preparation of humanized monoclonal antibody and its clinical application.

Keyword: Thyroglobulin; Humanized antibody; Monoclonal antibody

甲状腺癌是常见的内分泌系统肿瘤, 发病率女性多于男性。目前对分化性甲状腺癌的治疗通常采用“ 甲状腺全切或次全切加131I治疗” 的联合治疗策略。但对于不能摄取131I的分化型、低分化型、未分化型甲状腺癌及转移灶系统治疗或化疗疗效甚微, 死亡率高。

本院制备了抗Tg mAb杂交瘤细胞株, 并且已应用此单克隆抗体建立了Tg双抗体放射免疫药盒, 对于不能摄取131I的分化型、低分化型、未分化型甲状腺癌转移灶的诊断及治疗有一定的作用。但是鼠源性单克隆抗体血清中半衰期短, 无法有效地产生稳定的治疗作用, 甚至还会诱发人体产生人抗鼠抗体反应(human antigen mouse antibody, HAMA) , 引起超敏反应。本研究拟采用分子生物学方法, 将本院已获得的并证明有生物学活性和临床应用价值的鼠源性单克隆抗体进行人源化, 获得了能稳定分泌抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin, hTg)人源化抗体的细胞株, 为进一步大量获得人源化的hTg抗体及临床应用奠定了基础。

材料和方法
一、材料

分泌抗hTg特异性单抗hTg株由本院制备及保存; 大肠杆菌DH5α 本室保存; T4 DNA 连接酶、pMD-18-T载体、BamH I和Hind III限制性内切酶均为大连宝生物公司产品。Taq 酶、反转录试剂盒购自深圳中晶公司。质粒小抽试剂盒及DNA片段回收试剂盒为Tiangen公司产品。琼脂糖胶购自上海申能博彩生物科技有限公司。Trizol试剂购自上海市华舜生物有限公司。Ployfect脂质体转染试剂盒为QIAgen公司产品。DMEM及血清购自GIBCO公司。pVL_CL及pCMV_CH载体及CHO细胞由上海市肿瘤研究所赵新泰老师惠赠。

二、PCR引物的设计

根据鼠源性IgV 区基因的两端信号肽及FR4 保守序列, 设计并由上海申能博彩生物科技有限公司公司合成了一套分别扩增IgV 区基因的通用引物。通过将逐对引物匹配试验, 获得扩增VH、VL基因较好的2对引物, 即VH For: 5'-GCGAATTCAGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG-3'VH Back: 5'-TGAGGAGACGGTCACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'和 VL For: 5'-GACATTGAGCTCAC(C/A)CAGTCTCC-3'、VL Back: 5'-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3'。

三、RNA的提取和cDNA制备

从分泌mAb hTg的杂交瘤细胞中, 用Trizol试剂提取细胞总RNA, 参照反转录试剂盒说明以oligo(dT)20为引物鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)反转录酶反转录合成cDNA。

四、mAb hTg重、轻链基因的扩增、克隆及测序

以所制备的cDNA 为模板, 用VH For、VH Back和 VL For、VL Back引物分别扩增VH、VL基因。扩增体系为10μ L, 扩增条件为:94℃预变性3min, 94℃变性30s, 60℃退火30s, 72℃延伸30s, 共30个循环, 最后于72℃再延伸10min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定, 并用DNA片段回收试剂盒回收PCR产物。将回收的VH、VL基因分别克隆到pMD-18-T载体中, 以连接产物转化大肠杆菌DH5α , 于37℃倒置培养过夜。挑取克隆, 抽提质粒后进行酶切鉴定, 所获阳性克隆由上海生物工程有限公司测序。

五、设计人源化抗体基因的引物及人源化重、轻链基因的扩增

基于人源化抗体引物设计原则设计了人源化抗体的引物VH1: 5'-GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'VH2: 5'-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3'和VL1:5'-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3'VL2:5'-ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3', 以所抽提的pMD-18-T-VH和pMD-18-T-VL质粒为模板, 用人源化抗体的引物分别扩增人源化的VH、VL基因。扩增体系为25μ L, 扩增条件为:94℃预变性3min, 94℃变性30s, 56℃退火30s, 72℃延伸30s, 共30个循环, 最后于72℃再延伸10min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定, 并用DNA片段回收试剂盒回收PCR产物。

六、mAb hTg人源化重、轻链基因的克隆

将回收的人源化的VH、VL基因PCR产物用BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ 双酶切并分别克隆到经相同酶切的pCMV_CH及pVL_CL载体中, 以连接产物转化大肠杆菌DH5α , 于37℃倒置培养过夜。挑取克隆, 抽提质粒后进行酶切鉴定, 所获阳性克隆由上海生物工程有限公司测序。

七、pCMV_CH_VH及pVL_CL_VL共转染CHO细胞

在转染前1d将CHO- dhfr-细胞按照4× 105个/孔接6孔板, 加入3mL DMEM高糖培养基(含10%新生牛血清、0.2mmol/L次黄嘌呤、0.03mmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、2mmol/L谷胺酰胺)37℃ 及 5% CO2培养24h。按照Ployfect转染试剂说明书要求将构建好的pCMV_CH_VH及pVL_CL_VL质粒进行共转染CHO细胞。

八、筛选及鉴定分泌人源化抗体的细胞株

转染后24h 加入含200μ g/mL的G418的选择培养基进行筛选CHO细胞克隆, 待克隆形成后换新鲜CHO专用无血清培养基, 每天收集上清, 连续收集5d。分别用放射免疫和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法检测上清是否有抗体分泌。按照放射性免疫试剂盒说明书的要求, 将标记I125的人Tg蛋白直接与连续收集5d的细胞培养上清37℃反应1h, 加入免疫分离剂37℃作用15min, 3 500 r/min离心15min, 弃上清, 用γ 计数器测沉淀的放射性强度, 实验以CHO dhfr-细胞上清作为阴性对照。

结 果
一、 hTg VH 和VL 基因的PCR扩增

从杂交瘤细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA。用特异性引物进行PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 出现的40Obp左右2条带分别为VH和VL基因片段, 见图1。

图1 hTg VH、VL基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

二、VH和VL基因的克隆、鉴定及序列分析

VH、VL基因的PCR产物, 经胶回收试剂盒回收后, 分别克隆入pMD-18-T载体中, 并转化大肠杆菌DH5α 。再对克隆PCR鉴定。电泳出现大约400bp左右的片段, 初步鉴定为阳性克隆(电泳结果未显示)。得到的pMD-18-T-VH和pMD-18-T-VL克隆经测序, 并与鼠源性Ig Blast数据库相比较, 表明VH基因全长为411bp, 编码137个氨基酸, 有完整的4个骨架区(FR)和3个互补决定区(CDR)结构, 属于小鼠免疫球蛋白IgGI亚类。VL基因全长为396bp, 编码132个氨基酸, 同样也具有完整的骨架区和CDR结构, 属于小鼠Kappa链IV亚类。

三、人源化VH和VL基因的扩增

基于人源化抗体引物设计原则和对测序结果的分析, 我们设计了7条人源化抗体的引物, 进行PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 出现的约400bp左右2条带分别为VH和VL基因片段(见图2)。

图2 人源化引物扩增hTg VH、VL基因的琼脂糖凝胶电泳分析

四、hTg人源化重、轻链基因的克隆

将回收的人源化的VH、VL基因PCR产物BamH I和Hind III双酶切并分别克隆到经相同酶切的pCMV_CH及pVL_CL载体中, 以连接产物转化大肠杆菌DH5α , 于37℃倒置培养过夜。挑取克隆, 抽提质粒, 用BamH I和Hind III双酶切酶切鉴定(见图3) , 可见有约400bp左右的条带切出, 为正确克隆并将其送上海生物工程有限公司测序, 测序结果表明序列完全正确。

图3 人源化hTg VH、VL基因克隆用BamH I和Hind III双酶切的琼脂糖凝胶电泳分析

五、筛选及鉴定分泌人源化抗体的细胞株

采用放射免疫试剂盒, 经γ 计数器测沉淀的放射性强度, 结果上清的放射性强度大于阴性组, 结果见表1。将连续收集5d的细胞培养上清进行SDS-PAGE检测, 以CHO dhfr-细胞上清作为阴性对照。结果显示上清有蛋白表达, 且条带大小与IgG位置相同(结果见图4)。

表1 各单克隆无血清培养5 d培养液放射免疫检测结果(单位:cpm)

图4 CHO专用无血清培养基培养后取不同时间细胞培养液SDS-PAGE结果

讨 论

hTg是甲状腺滤泡上皮细胞合成的一种蛋白质, 与甲状腺癌的发生有较为密切的关系。目前对分化型的甲状腺癌常规以131I作为定性、定位显像及治疗的主要方法, 但对不能摄取131I 的分化差和未分化型的甲状腺癌的转移灶的定性、定位显像及治疗较困难。本院曾制备了抗hTg-McAb[2]。但是该单克隆抗体是鼠源性的, 鼠源性单克隆抗体在应用于人体治疗时有诸多问题: 一是不能有效地激活人体中补体和Fc 受体相关的效应系统; 二是被人体免疫系统所识别, 产生HAMA; 三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此, 在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造, 减少异源抗体的免疫原性, 成为单克隆抗体研究的重点[2]。近年来人源化抗体作为治疗剂又再度成为生物技术药物领域最引人注目的研究热点[3, 4]。目前美国食品与药品监督管理局(FDA)批准的新药中, 已有100 多种人源化单抗进行了临床试验, 其中数十种抗体相关新药得到了应用[5]。人源化抗体研究经历了3个阶段, 即从嵌合抗体[6], 互补性决定区(CDR) 移植抗体[7]及用噬菌体表面展示技术[8]和转基因小鼠制备[9]的全人单克隆抗体。一般来说, 转基因小鼠是目前生产全人单抗的最理想的方法, 但技术难度较大, 并未获得真正的突破。所以, 对人源化抗体的研究主要还是集中在嵌合抗体和CDR 移植抗体上。本研究采用分子生物学的方法, 改造了抗hTg鼠源性的单抗, 使之人源化, 并成功的筛选到6株能稳定分泌人源化抗体的CHO细胞株, 为进一步大量制备人源化的抗hTg单抗及临床应用奠定了基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 高克加 沈江帆 张乃康, 等. 不能摄取131I的甲状腺癌转移灶的131I-hTgMcAb显像及初步治疗[J]. 核技术, 2005, 1(28): 46-49. [本文引用:1]
[2] 朱学泰, 谢溱, 马瑞君. 单克隆抗体制备技术研究进展[J]. 甘肃科技, 2005, 21(3): 108-111. [本文引用:2]
[3] 霍晨敏, 朱昀, 孙进伟, 等. 单克隆抗体制剂的最新进展[J]. 河北师范大学学报, 2004, 28(5): 519-523. [本文引用:1]
[4] 汤仲明. 生物技术药物的最新进展和展望[J ]. 国外医学, 2002, 21(2): 115-117. [本文引用:1]
[5] 王臣, 温文彦, 张春杰. 鼠源单克隆抗体人源化研究进展[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(11): 2336-2339. [本文引用:1]
[6] Winter G, Harris WJ. Humanized Antibodies [ J ]. Immunology Today, 1993, 14(6) : 243-246. [本文引用:1]
[7] Luo GX, Kohlstaedt LA, Charles CH, et al. Humanization of an anti-ICAM-1 antibody with over 50 fold affinity and functional improvement [J ]. J Immunol Methods , 2003 , 275(122) 31-40. [本文引用:1]
[8] Higo Moriguchi K, Akahori Y, Iba Y, et al. Isolation of human monoclonal antibodies that neutralize human rotavirus[J ]. J Virol , 2004 , 78(7) : 3325-3332. [本文引用:1]
[9] Green LL. Antibody engineering via genetic engineering of the mouse : Xenomouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies[J ]. J Immunol Methods , 1999 , 231(122) : 11-23. [本文引用:1]