引用本文
朱岚, 黄飚, 张珏, 裴豪, 刘海燕. 血清透明质酸时间分辨荧光免疫分析法的反应条件优化及其临床应用. 2009, 24(2): 124-126
ZHU Lan, HUANG Biao, ZHANG Jue, PEI Hao, LIU Haiyan. Optimization of reaction conditions of the time-resolved fluoroimmunoassay for hyaluronic acid detection in serum and its clinical application. Labratory Medicine, 2009, 24(2): 124-126  
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血清透明质酸时间分辨荧光免疫分析法的反应条件优化及其临床应用
朱岚1, 黄飚1, 张珏1, 裴豪2, 刘海燕1
1.江苏省原子医学研究所,江苏 无锡 214063
2.无锡市传染病医院检验科,江苏 无锡 214065

作者简介:朱 岚,女,1979年生,学士,实习研究员,主要从事血清免疫学临床应用研究。

基金:江苏省社会发展基金资助项目(BS2004009)
摘要
目的

优化血清透明质酸(HA)时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)的反应条件,并探讨其临床应用价值。

方法

采用TRFIA检测血清中HA的含量,确定参与HA-TRFIA的各反应成分的浓度。

结果

最佳反应条件为包被浓度10 mg/L、HA 结合蛋白(HABP)1:500稀释、铕标记HA(Eu3+-BSA-HA)1:200稀释。敏感性为5.17 μg/L,批内变异系数( CV)为2.21%~3.78%, 批间 CV为3.73%~5.40%,平均回收率为100.4%。该法HA测定值与放射免疫测定值显著相关,且与临床结果一致。

结论

本研究建立的血清HA-TRFIA是一种灵敏准确的分析方法,适合临床应用。

关键词: 时间分辨荧光免疫分析法; 反应条件; 优化; 透明质酸
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)02-0124-03
Optimization of reaction conditions of the time-resolved fluoroimmunoassay for hyaluronic acid detection in serum and its clinical application
ZHU Lan1, HUANG Biao1, ZHANG Jue1, PEI Hao2, LIU Haiyan1
1.Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Jiangsu Wuxi 214063, China
2.Department of Clinical Laboratory,Wuxi Infectious Disease Hospital, Jiangsu Wuxi 214065,China
Abstract
Objective

To optimize the reaction conditions of the time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA)for hyaluronic acid (HA)detection in serum and explore its clinical application.

Methods

The serum levels of HA were detected by TRFIA.The different concentrations of the compositions in the HA-TRFIA system were set up.

Results

The optimum concentrations of goat anti-rabbit IgG,HA binding protein(HABP) and europium-labeled HA (Eu3+-BSA-HA)were 10 mg/L,1:500 and 1:200, respectively. The analytical sensitivity was 5.17 μg/L. The within- run and between-run coefficients of variation were 2.21%-3.78% and 3.73%-5.40%,respectively.The average recovery rate was 100.4%. The results had significant co-relationship with radioimmunoassay, and was consistent with the clinical diagnosis.

Conclusions

The competitive TRFIA for HA detection in serum is a sensitive and reliable assay. It would be suitable for clinical diagnosis.

Keyword: Time-resolved fluoroimmunoassay; Reaction condition; Optimization; Hyaluronic acid

透明质酸(hyaluronic acid, HA)主要产生于间质细胞(纤维母细胞), 经淋巴进入血液。肝脏是HA代谢的主要器官, 所以血清 HA含量与肝脏疾病及肝功能状况密切相关, 故能较好地反映肝脏病变的程度和评估肝病发展趋势[1]。临床上把HA列为肝纤维化尤其是肝硬化最有效的非创伤性检测标志物[2]。本研究建立了HA时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA), 并优化其反应条件。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象 无锡市传染病医院肝病住院和门诊患者104例, 男57例, 女47例, 年龄23~78岁。急性肝炎28例, 慢性肝炎55例(轻度21例、中度18例、重度16例), 肝硬化21例。30名正常献血员为江原医院健康体检人员, 男15名, 女15名, 年龄 18~60岁。均静脉采血2 mL, 分离血清, -20 ℃保存待检。

2. 主要试剂和仪器 HA、HA结合蛋白(HA binding protein, HABP)、HABP抗体, HA参考标准, HA高、中、低质控品, 由上海海研医学生物技术有限公司提供。羊抗兔IgG, 华美生物工程公司产品。铕(Eu3+)标记盒(1244-302), PE产品。96 孔微孔板, NUNC产品。牛血清蛋白(BSA), Sigma产品。HA-BSA、发光增强液、浓缩洗涤液、反应缓冲液, 由江苏省原子医学研究所提供。其余试剂为国产分析纯试剂。紫外可见分光光度计(TU-1901/TU-1900), 北京普析通用仪器有限责任公司提供。全自动TRFIA检测仪(Auto DELFIA1235) , PE产品。放射免疫分析仪为北京产FT-630G。HA放射免疫试剂盒由上海海研医学生物技术有限公司提供, 按说明书进行操作。

二、方法

1. 包被浓度比较 将羊抗兔IgG, 采用50 mmol/L pH值9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液分别稀释至1、2、4、8、16、32 mg/L, 在96孔微孔板各孔中加入200 μ L, 4 ℃过夜, 弃去包被液洗涤3次, 每孔加200 μ L含3 g/L BSA的缓冲液封闭, 4 ℃过夜, 弃去封闭液真空抽干后冷冻保存。分别进行HA-TRFIA。

2. HABP稀释比例的选择 用反应缓冲液1: 250、1: 500、1: 1 000分别稀释 HABP, 然后进行HA-TRFIA。

3. Eu3+-BSA-HA稀释比例的选择 取500 μ g HA-BSA加入含0.2 mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)冻干粉的小瓶中, 30 ℃磁力搅拌反应16 h。反应液经用80 mmol/L pH值7.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液平衡的琼脂糖凝胶CL-6B柱(1 cm× 40 cm)层析, 紫外可见分光光度计在波长280 nm条件下监测收集蛋白峰。用反应缓冲液1: 100、1: 200、1: 400稀释Eu3+-BSA-HA, 然后进行HA-TRFIA。

4. 临床试验 在选定最佳反应条件下, 对134例肝病患者和正常体检查进行HA-TRFIA, 并与放射免疫分析法(RIA)的测定结果进行对比。

5. HA-TRFIA的反应步骤 在包被二抗的微孔板中加入用反应缓冲液稀释的HABP抗体100 μ L, 25 ℃振荡1 h, 洗涤液洗3次, 加入反应缓冲液稀释的HABP 100 μ L, 25 ℃振荡1 h, 洗涤液洗3次, 加入标准品或标本50 μ L和反应缓冲液稀释的Eu3+ -BSA-HA 50 μ L, 25 ℃振荡1 h, 洗涤液洗6次, 加增强液振荡5 min后测量。测量过程在Auto DELFIA1235上完成。软件程序自编。

结 果
一、包被浓度比较

随着包被抗体浓度的提高, 结合率也提高, 但在10 mg/L以后, 浓度的增加对结合率的影响不大, 所以10 mg/L为最佳包被浓度。

二、HABP稀释比例的选择

抑制率为最高结合率的30%~50%时对应的稀释度为最佳稀释比例, 此时稀释比例为1: 500。

三、Eu3+-BSA-HA稀释比例的选择

当稀释比例为1: 200时结合率较高, 而本底较低, 选为最佳稀释比例。

四、试剂盒的评估

测定HA参考标准时标准曲线在浓度0~800 μ g/L范围内线性良好, 根据零标准管的 x̅+2s计算出最小检出限为5.17μ g/L。同批次试剂盒测定高、中、低质控同次重复20孔, 批内变异系数(CV)为2.21%~3.78%; 不同批次试剂盒对高、中、低质控品连续检测10次, 批间CV为3.73%~5.40%, 见表1。取已知HA含量为 319 μ g/L的血清标本分别加入高、中、低质控品进行回收试验, 回收率分别为102.2%、100.6%、98.3%, 平均回收率为100.4%。本研究建立的HA-TRFIA 同批试剂在37 ℃孵育箱中放置4 d连续每天测定, 发现标准曲线基本重合, 无明显漂移, 稳定性良好, 可以用同批试剂单次标准曲线作为今后分析的固定参考。

表1 批内和批间变异统计表
五、临床试验

在该反应条件下TRFIA和RIA结果显著相关(Y=1.025 7X+ 9.052, r = 0.946 7, P< 0.01), 且结果与临床诊断一致, 见表2。

表2 2种方法检测血清HA在正常人及各组肝病患者中的含量比较( x̅± s, μ g/L)
讨 论

HA是肝纤维化、肝硬化无创性血清学诊断中较好的指标, 也可作为肝纤维化和肝硬化预后的指标[3]。由于HA 分子结构的特点, 很难用常规方法对其进行微量分析。HA的天然对应体HABP的发现和应用为HA定量开拓了新途径。但HABP不稳定, 不能用直接竞争结合法进行检测[4]。TRFIA同其他免疫学检测技术一样, 抗原和抗体的结合反应是在一个特定的环境条件下进行的, 包括参加反应的抗原、抗体的浓度和比例[5]。本研究建立的HA-TRFIA采用间接竞争法, 用比较稳定的二抗包被固相板。先在固相板上包被过量的羊抗兔IgG(二抗), 要先对固相包被板上的羊抗兔IgG的浓度进行选择。实验表明, 包被量过少时, 结合率过低, 敏感性不够; 但当包被浓度达到10 mg/L以上后, 用不同浓度的羊抗兔IgG包被固相并经过足够的洗涤后, 固相表面的最后浓度几乎相等, 因此包被浓度过高会造成浪费, 增加成本。所以选择10 mg/L这个包被浓度为最佳包被浓度。第1步反应加入抗HABP(一抗)连接到二抗板上。第2步加入定量的HABP, 其量相对于标准品、标本和Eu3+标记中的HA浓度是不足的。当抑制率为最高结合率的30%~50%时对应的稀释度为最佳稀释比例, 此时稀释比例约为1: 500。第3步加入标准品或标本, 同时加入Eu3+ -BSA-HA, 共同竞争定量的HABP, 进行间接竞争免疫反应。Eu3+-BSA-HA的浓度过稀, 结合率过低, 标准品各浓度点计数相差太少, 敏感性太低; 浓度过浓, 结合率高, 但本底太高; 当稀释比例为1: 200时反应曲线斜率最大, 结合率较高, 本底低, 标准品各浓度点计数相差最大, 误差最小, 敏感性最高, 所以选为最佳稀释比例。

该方法测定血清HA含量的最小检出限为5.17 μ g/L, 远好于进口的酶联免疫吸咐试验(ELISA)试剂盒(最小检出限为50 μ g/L)[6], 具有良好的精密度, 符合临床要求。本研究选择不同阶段肝病患者血清和正常人血清用目前临床上最普遍的RIA与TRFIA进行比对实验, 结果显示两者高度相关, 且与肝病患者肝纤维化程度相符。随着慢性化进展逐渐升高, HA含量增加, 分别为肝硬化> 重度慢性肝炎> 中度慢性肝炎> 轻度慢性肝炎> 急性肝炎, 慢性肝病各型、肝硬化显著高于正常对照(P< 0.01), 急性肝炎则差异无统计学意义(P> 0.05), 与文献报道一致[7]。说明HA是判断慢性肝炎肝纤维化程度较为敏感的指标, 能为临床肝纤维化和肝硬化的诊断和治疗提供可靠的依据。优化反应条件后的HA-TRFIA具有特异性高、敏感性高、无放射性污染等优点, 值得推广。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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