空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究
引用本文
凌霞, 沙丹, 肖勇, 张敬平, 吴家林. 空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究. 2009, 24(2): 101-105
LING Xia, SHA Dan, XIAO Yong, ZHANG Jing-ping, WU Jia-lin. Study on multiplex PCR assay for detection of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 . Labratory Medicine, 2009, 24(2): 101-105
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LING Xia, SHA Dan, XIAO Yong, ZHANG Jing-ping, WU Jia-lin. Study on multiplex PCR assay for detection of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 . Labratory Medicine, 2009, 24(2): 101-105
Copyright©2009, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究
作者简介:凌 霞,女,1964年生,硕士,高级工程师,主要从事卫生检验研究。
摘要
目的
建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应(PCR)检测技术。
方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素(hly)基因序列和大肠杆菌的O157抗原(rfbE)基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。
结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6~8 h。
结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。
关键词:
多重PCR; 空肠弯曲菌; 单增李斯特菌; 大肠杆菌O157
中图分类号:R373.1
文献标志码:A
文章编号:1673-8640(2009)02-0101-05
Study on multiplex PCR assay for detection of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157
Abstract
Objective
To establish a multiplex PCR method and apply multiplex PCR for simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157.
MethodsAccording to DNA sequences of the mapA gene of Campylobacter jejuni, the hly gene of Listeria monoytogenes and the rfbE gene of Escherichia coli O157, three pairs of specific primers were screened and designed to compose optimized system and conditions of multiplex PCR. The three expected sizes were 589bp for Campylobacter jejuni, 360bp for Listeria monocytogenes and 194bp for Escherichia coli O157.
ResultsThe detection sensitivity of multiplex PCR were 2.264ng、 37.92ng and 2.100ng for Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157, respectively. The multiplex PCR took 6-8 hours to detect a sample.
ConclusionsThe results of the experiments demonstrated that the multiplex PCR assay was rapid, simple, sensitive and specific, Which establish important foundation for simultaneous detection for these three bacteria in polluted sample.
Keyword:
Multiplex PCR; Campylobacter jejuni; Listeria monocytogenes; Escherichia coli O157
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, C.jejuni) 、大肠杆菌O157(Escherichia coli O157, E. coli O157)、单核细胞增生性李斯特菌[简称单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm) ]等致病菌是引起肠道细菌性感染和细菌性食物中毒的重要病原体。近几年, 大肠杆菌O157 作为一种重要的食源性致病菌在我国畜禽等与人接触密切的动物粪便中的检出率非常高。单增李斯特菌主要污染肉类、乳制品和蔬菜等, 这就使得食品在储运、加工过程中容易被单增李斯特菌污染; 空肠弯曲菌是二十世纪80年代起受到国内外广泛重视的人畜共患病原菌, 该菌广泛存在于家禽类动物的肠道中, 污染水源或食物后可引起腹泻的爆发。
常规检测这些致病菌需分离培养、生化和血清学鉴定等[1]多个步骤, 操作复杂, 检测周期长(4~7d) , 因此迫切需要发展快速、灵敏和特异的检测方法, 对于预防和控制这些疾病的发生和流行至关重要。本研究以大肠杆菌O157的抗原(rfbE)基因[2]、单增李斯特菌的编码溶血素(hly)基因[3]和空肠弯曲菌的保守序列mapA基因[4]作为研究对象, 建立一种稳定的、高敏感性和特异性的多重PCR体系, 对快速、准确的一次性检测3种病原菌感染状况进行探讨。
材料和方法
一、材料
1. 菌株 空肠弯曲菌ATCC33291、单增李斯特菌ATCC13932、蜡样芽孢杆菌ATCC11778、奇异变形杆菌ATCC12453、金黄色葡萄球菌ATCC33592、副伤寒沙门菌ATCC50073、宋内志贺菌ATCC51334、乙型溶血性链球菌ATCC19615购于美国MBL公司, 实验室相关菌株13类共162株。菌株都由无锡市疾病预防控制中心收集保存, 大肠杆菌O157 2株为国家实验室考核菌株。空肠弯曲菌接种在CCDA, 42℃ 微需氧培养48h, 其他菌株都接种营养琼脂斜面, 37℃培养18h后备用。
2. 仪器 PCR扩增仪、5417R型台式高速冷冻离心机、恒温振荡器、核酸蛋白分析仪(德国Eppendorf公司)。Tanon 4100型凝胶成像系统、EPS - 300A型电泳仪(上海天能科技公司)。
3. 试剂 Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L)、10× PCR Buffer (Mg2+ free) 、MgCl2(25 mmol/L) 、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 、100 bp DNA ladder Marker (均购于大连宝生物工程有限公司)、GOLDVIEWTM染料购于上海赛百盛基因技术有限公司, 琼脂糖(购于美国Promega公司)。
二、方法
1. 细菌总DNA的提取 分别取空肠弯曲菌ATCC33291、大肠杆菌O157、单增李斯特菌ATCC13932菌株和其他菌株于各自选择性培养基中培养24 h, 37℃, 150 r/min。取增菌液于1.5 mL离心管中, 12 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 沉淀中加入100 μ L裂解液, 混匀后100℃金属浴15 min, 10 000 r/min离心1 min, 取上清液-20 ℃保存备用。空肠弯曲菌DNA浓度4.528 1 mg/mL、大肠杆菌O157 DNA浓度4.199 5 mg/mL、单增李斯特菌DNA浓度1.896 2 mg/mL。
2. 引物及基因的设计 根据大肠杆菌O157 rfbE基因、单增李斯特菌hly基因及空肠弯曲菌保守基因mapA基因序列设计各菌引物, 用Primer5.0 软件设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 见表1。
 | 表1 多重PCR扩增的目的基因及引物设计 |
3. 单基因PCR扩增及特异性分析 对空肠弯曲菌ATCC33291、大肠杆菌O157、单增李斯特菌ATCC13932菌株的DNA进行单独扩增, 反应体系为:Taq DNA聚合酶1U、10× PCR Buffer 2.5 μ L、Mg2+ 2 mmol/L、dNTP Mixture 200 μ mol/L, 上下游引物(10 mmol/L)各50 nmol/L, 模板DNA 1 μ L其余用无菌的去离子水补足, 总体积25 μ L。PCR扩增条件: 94℃ 预变性5 min, 然后按94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 90 s共35次循环, 最后72 ℃延长至5min。10 μ L PCR产物经GOLDVIEWTM染料染色, 以DNA Marker作相对分子质量指示, 于100V电压下行15g/L的琼脂糖电泳40 min, 置凝胶成像系统中进行结果分析。
4. 单管多重PCR的扩增反应体系 反应体系: Taq DNA 聚合酶1U、10× PCR Buffer 2.5 μ L、Mg2+2 mmol/L、dNTP Mixture200 μ mol/L, 上下游引物(10 mmol/L)3对引物各100 nmol/L, 模板DNA3 μ L(3种菌各1 μ L), 其余用无菌的去离子水补足, 总体积25 μ L。其他条件同上述。
5. 单管多重PCR的扩增条件优化 对影响PCR扩增条件的模板、引物和聚合酶浓度以及和退火温度, 用设计的特异性引物进行PCR扩增, 确立最佳的PCR反应条件。
6. 单管多重PCR特异性分析 选取上述菌株按已优化的条件进行PCR扩增检测。
7. 单基因PCR与单管多重PCR敏感性分析 将已测定DNA浓度的空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157模板DNA按100~10-8梯度稀释, 每一稀释度的模板通过加入单对引物与优化浓度的多重引物在相同条件下扩增, 进行敏感度比较; 将梯度稀释后的3种模板分别混合, 按已优化的多重PCR条件扩增, 测定多重PCR扩增敏感度。
8. 人工污染样品检测 将分别含有106cfu的空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157各0.1 mL混合的菌液, 分别加入到100 mL水样、10 g肉样及10 g海产品中, 提取DNA进行多重PCR检测。
结 果
一、单基因PCR特异性分析
分别用设计的单重引物对空肠弯曲菌、大肠杆菌及单增李斯特菌进行PCR, 结果表明8株空肠弯曲菌株均出现552 bp的扩增条带, 8株大肠杆菌O157均出现196 bp的扩增条带、12株单增李斯特菌均出现360 bp的扩增条带, 其他菌株无特异性扩增条带出现。3个PCR产物均与实际设计的大小相符, 而其他菌则没有扩增条带出现。结果见图1。
 | 图1 3种致病菌单重PCR扩增结果 |
二、多重PCR反应条件优化
1. 引物浓度对多重PCR反应的影响 选取被试菌的3对引物, 分别按一定的引物浓度梯度使用上述条件进行PCR扩增, 获取各自出现条带的最低浓度, 并对扩增的条件进一步优化。对PCR影响较大的3对引物的浓度及Mg2+浓度, 分别在一定范围内进行L9(34)正交试验, 结果显示当25 μ L PCR反应体系中影响较小的反应条件固定不变时(Taq DNA 聚合酶1U、10× PCR Buffer2.5 μ L、Mg2+ 2 mmol/L、dNTP Mixture各200 μ mol/L ), 其最适引物浓度为:空肠弯菌上下引物浓度各为50 nmol/L 、单增李斯特菌上下引物浓度各为100 nmol/L、大肠杆菌O157上下引物浓度各为120 nmol/L。结果见图2。
 | 图2 初步检测和条件优化后检测结果 |
2. 退火温度对多重PCR反应的影响 根椐退火温度一般应低于Tm值3~5℃的原则, 选择50℃、50.2℃、50.8℃、51.7℃、52.8℃、54.1℃、55.4℃、56.7℃、57.9℃、58.8℃、59.5℃、59.9℃12个温度梯度研究退火温度对多重PCR反应的影响, 部分结果见图3。结果显示在50℃~52.8℃、55.4℃~56.7℃条带显示有较好的扩增效果, 但考虑退火温度低时易产生非特异性的扩增, 因而选用55.4℃作为最佳退火温度。
优化的多重PCR反应条件:25 μ L的PCR体系中10× PCR Buffer 2.5 μ L, 2 mmol/L Mg2+, 200 μ mol/L dNTP, Taq DNA 聚合酶1 U, 引物浓度为:空肠弯菌50 nmol/L、单增李斯特菌100 nmol/L、大肠杆菌O157 120 nmol/L。循环参数为:94℃ 预变性5 min, 然后按94 ℃ 40 s、55.4 ℃ 40 s、72 ℃ 90 s共35次循环, 最后72 ℃ 延长至5 min。
 | 图3 不同退火温度对多重PCR的影响 |
三、单管多重PCR特异性分析
分别以3种被试菌提取的1种DNA为模板, 2种、3种提取的混合DNA为模板, 均加入3对引物扩增, 结果见图4。图中表明单一模板出现1条特异性扩增带, 混合模板出现2条和3条特异性扩增条带, 并无特异性条带和引物二聚体的形成, 与预期的扩增结果一致。
 | 图4 3种致病菌单管多重PCR的特异性检测结果 |
四、单管多重PCR敏感性分析
分别将3种菌的DNA模板倍比稀释, 以单独的DNA模板进行单重和3重引物扩增, 结果显示空肠弯曲菌单重PCR检测的敏感度达到226.4 pg, 多重PCR检测的敏感度达到2.264 ng; 单增李斯特菌单重PCR检测的敏感度达到379.2 pg, 多重PCR检测的敏感度达到3.792 ng; 大肠杆菌O157单重PCR检测的敏感度达到210.0 pg, 多重PCR检测的敏感度达到2.100 ng; 以3种菌的混合模板梯度稀释进行多重PCR扩增, 结果见图5, 空肠弯曲菌为2.264 ng, 单增李斯特菌为37.92 ng, 大肠杆菌O157为2.100 ng。由于模板、引物等的干扰致使多重扩增的敏感度低于单重扩增敏感度, 李斯特菌单一DNA模板的敏感度高于混合菌中的敏感度。
 | 图5 3种致病菌多重PCR敏感度比较结果 |
讨 论
本研究中选取的rfbE是O157抗原的特异性基因, 所有的O157:H7产毒或不产毒株, 进行PCR扩增后此片段都可扩出, 其他非O157:H7均为阴性, 有较好的特异性[2]。Wang等[5 ]通过对E.coli的166种不同的血清型O抗原基因簇的测序结果发现存在于大肠杆菌O157中的rfbE基因其基因序列与其他细菌的类似功能基因的序列没有同源性。因此, 本研究采用了rfbE基因作为大肠杆菌O157的标志, 达到了对O157: H7的准确检测。编码单增李斯特菌溶血素O(listeria monocytogenes listeriolysin O, LLO)的hly基因为单增李斯特菌最典型的毒力基因。LLO是一种与破坏吞噬体、促进菌体进入胞液有关的孔形成毒素, 其的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失, 可作为单增李斯特菌毒力菌株的标志[3]。也是李斯特菌属内, 单增李斯特菌特有的毒力基因, 所以hly基因己经被广泛作为检测单增李斯特菌的特异性靶基因, 用于PCR检测鉴定。大多数PCR都选择了针对hly基因进行检测[6 -8]。Aznar等通过比较8对引物筛选出针对hly基因的引物, 扩增出702 bp片段, 在72株菌株( 标准菌株和食品分离株) 中特异地扩增单增李斯特菌的hly基因, 体现出了很强的特异性[9]。mapA基因是空肠弯曲菌的保守序列, 吴高林[ 4 ]等采用了弯曲菌属保守序列的23S、空肠弯曲菌的保守序列hipo基因和mapA基因, 建立了多重PCR方法与传统方法比较, 检测效率远远高于传统方法。
多重PCR 影响因素复杂, 不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP 浓度及其比例、缓冲液成分与浓度、反应体系、循环参数等会产生复杂的综合效应[10]。本体系中引物浓度、Mg2+浓度、退火温度等对PCR反应的特异性和反应效率影响较大。对选取的目的菌株和非目的菌株同时进行PCR扩增, 结果目的菌株均显示出特异扩增, 而所有非目的菌株均不出现扩增条带, 说明引物有很强的特异性。比较单一PCR 和多重PCR检测3种被试菌的敏感度, 显示多重PCR反应所需的模板浓度高于单重PCR的模板浓度, 说明多重PCR 对敏感度有较大的影响, 包括引物的相互影响, 引物浓度、退火温度等的影响。因被试的3种菌在实际工作中常常因生存状态的差异, 在检测工作中可能以优势菌的生长检测更为常见, 采用该方法可检测出污染物中优势菌的污染情况, 缩短了检测的周期, 有较高的特异性和敏感度, 可在食品污染物监测、食物中毒以及应对突发公共卫生事件中发挥重要作用。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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