引用本文
卢仁泉, 郑佐娅, 郭林. 联合检测甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析试剂的研制及性能评价. 2009, 24(12): 899-903
LU Renquan, ZHENG Zuoya, GUO Lin. Development of a gold immunochromatographic assay reagent for rapid detection of alpha-fetoprotein and carcinoembryonic antigen and evaluation of its performance. Labratory Medicine, 2009, 24(12): 899-903  
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联合检测甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析试剂的研制及性能评价
卢仁泉1, 郑佐娅2, 郭林1
1.复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海 200032
2.上海交通大学医学院医学检验重点实验室,上海 200023

作者简介:卢仁泉,男,1975年生,硕士,主管技师,主要从事临床免疫学工作。

通讯作者:郭 林,联系电话:021-64175590-2204。

摘要
目的

建立一种新型的联合检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的胶体金免疫层析法(GICA)。

方法

G4和C2为一对抗AFP单克隆抗体(McAb),A1和C9为另一对抗CEA McAb,G4和A1分别以直线形式平行包被于固相硝酸纤维素(NC)膜上,C2和C9分别与胶体金结合后固定于结合物垫,制备成GICA试剂条。膜上另包被2 mg/mL兔抗鼠IgG抗体,用于检测有效性。

结果

利用双抗体夹心原理,建立了可同时检测血清中AFP和CEA的GICA。本法经AFP和CEA标准液测定,试剂的敏感性为AFP 30 μg/L、CEA 10 μg/L,与血红蛋白、人白蛋白、人球蛋白等无交叉反应,稳定性试验表明试剂可以在室温保存6个月以上。86份经化学发光免疫分析仪定量测定AFP、CEA浓度的临床血清标本用于本法的对比测定,符合性良好。

结论

联合检测AFP和CEA的GICA试剂具有结果可靠、方法简便、快速等优点,与化学发光法测定结果符合性良好。

关键词: 甲胎蛋白; 癌胚抗原; 胶体金; 免疫层析法
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0899-05
Development of a gold immunochromatographic assay reagent for rapid detection of alpha-fetoprotein and carcinoembryonic antigen and evaluation of its performance
LU Renquan1, ZHENG Zuoya2, GUO Lin1
1. Department of Clinical Laboratory, Cancer Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
2. Key Laboratory of Medical Laboratory Science, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200023, China
Abstract
Objective

To develop a novel gold immunochromatographic assay (GICA) for the detection of alpha-fetoprotein (AFP) and carcinoembryonic antigen (CEA) in serum.

Methods

The GICA strip was developed with one pair of anti-AFP monoclonal antibodies (McAb) G4/C2 and another pair of anti-CEA McAb A1/C9. G4 and A1 were coated on the nitrocellulose (NC) membrane as parallel lines, and C2 and C9 were labeled with colloidal gold respectively.2 mg/mL of rabbit anti-mouse IgG were also immobilized on the NC membrane for the controls of the assay.

Results

According to double antibody sandwich technique, the determination of AFP and CEA standard solution showed that the result of GICA could determine AFP and CEA levels simultaneously. The sensitivity of the kit was 30 and 10 μg/L in the determination of AFP and CEA respectively. The reagent was not interfered by hemoglobin, human albumin and human immunoglobulin and could be preserved at ambient temperature for 6 months. Simultaneous determination of 86 clinical serum samples by quantitative chemiluminescence immunoassay system and GICA gave coincident results.

Conclusions

The developed GICA for AFP and CEA is simple, rapid and reliable for clinical use. The strip determination result corresponds to those of chemiluminescence immunoassay.

Keyword: Alpha-fetoprotein; Carcinoembryonic antigen; Colloidal gold; Immunochromatographic assay

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)是胎儿肝细胞合成的一种糖蛋白。临床上AFP作为原发性肝癌(HCC)特异性较强的诊断指标, 经过二十多年实践已得到充分肯定[1]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)为具有人类胚胎抗原的酸性糖蛋白, 在恶性肿瘤中CEA阳性率则以腺癌最高, 对肝转移癌的价值亦较大。二者均为临床常用的肿瘤标志物。鉴于目前尚无一种标志物在敏感性、特异性方面均理想的状况, 进行多种标志物同步检测是提高恶性肿瘤诊断价值的重要方法[2]。胶体金免疫层析法(gold immuno-chromatographic assay, GICA)是上世纪90年代发展起来的一项新技术, 因其操作简便、快速, 主要用于临床辅助诊断, 体检时尤为适用。我们着重探索一种新的测定模式, 在同一GICA试剂条上同时检测AFP和CEA 2种肿瘤标志物, 以提高检测的阳性率。

材料和方法
一、材料

1. 抗AFP和抗CEA单克隆抗体(McAb) 2对McAb(抗AFP McAb G4/C2和抗CEA McAb A1/C9)腹水由上海交通大学医学院医学检验重点实验室提供[3]。

2. 硝酸纤维素(NC)膜 型号HF13502, 购自美国Millipore公司。

3. AFP、CEA参考标准品 AFP标准品(冻干品)36 000 IU/支, 购自中国药品生物制品检定所, 批号930120。用0.01 mol/L pH值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)使之溶解, 用AFP零值的小牛血清(杭州四季青生物公司)稀释, 配制成0、30、50、100、200、300 μ g/L 6种浓度的标准液, 置-40 ℃保存。CEA标准品(冻干品)160 ng/支, 购自中国药品生物制品检定所, 批号541-0106。直接用CEA零值的小牛血清(杭州四季青生物公司)稀释, 配制成0、10、20、40、80、160 μ g/L 6种浓度的CEA标准液, 置-40 ℃保存。

4. 临床试验血清标本 从肿瘤医院收集的临床送检AFP和CEA的血清标本86份, 用美国Beckman Coulter公司DXI800酶微粒子化学发光仪定量测定。

二、方法

1. 抗体的纯化 用辛酸法[4]从2对McAb腹水中纯化得到McAb G4/C2和A1/C9, 紫外分光光度计测定吸光度(A)280 nm和A260 nm。按公式计算抗体含量(mg/mL)=1.45× A280 nm-0.74× A260 nm。纯化所得到的McAb效价均在1× 10-6以上, 为IgG1类。其中抗AFP McAb C2用于标记胶体金, G4用于包被固相NC膜; 抗CEA McAb C9用于标记胶体金, A1用于包被固相NC膜。

2. 胶体金标记抗体复合物的制备 (1)胶体金的制备:用柠檬酸三钠还原法。在100 mL双蒸水中加入1%柠檬酸三钠1.5 mL, 煮沸后再加入1%氯金酸溶液1.0 mL, 继续煮沸15 min, 冷却备用; (2)胶体金标记抗AFP抗体:如上制备的胶体金溶液用0.1 mol/L碳酸钾调节pH值至中性, 按1/10(V/V)的比例加入0.3 mg/mL的抗AFP McAb C2溶液, 室温反应15 min后, 加入1%聚乙二醇, 8 000 r/min(离心半径为11.5 cm)离心30 min, 吸去上清。用含1%牛血清白蛋白(BSA)的0.02 mol/L PBS洗涤2次。最后沉淀重悬于相当于原体积1/5的1%BSA溶液中, 4 ℃保存; (3) 胶体金标记抗CEA抗体:加入的抗CEA McAb C9浓度为0.5 mg/mL, 其余操作同胶体金标记抗AFP抗体。

3. 联合检测AFP和CEA GICA试剂条的制备 (1)抗体的包被:用加样器将一系列不同浓度的抗CEA McAb A1溶液、抗AFP McAb G4溶液以及兔抗鼠IgG溶液以直线的形式平行点加到NC膜上的A、B、C处, A与B、B与C之间间距为3 mm; (2)胶体金标记抗体的固化:取已用含1%BSA的0.02 mol/L PBS稀释的胶体金标记抗CEA McAb C9溶液和胶体金标记抗AFP McAb C2溶液等体积混合, 按30 μ L/cm的比例加至结合物垫(GF33, Millipore公司)上, 干燥备用; (3)试剂条的黏贴、组装:按常规方式组装[5], 首先将包被了抗体的NC膜②黏贴于单面胶的塑料底板①上, 再依次黏贴胶体金结合物垫③、样品垫④以及吸水垫⑤, 两两之间分别重叠2 mm黏贴, 见图1。

图1 联合检测的GICA试剂条结构图注:(a)为俯视图; (b)为侧视图; ①单面胶的塑料底板; ②包被有抗体的NC膜; ③固定有金标抗体的结合物垫; ④样品垫; ⑤吸水垫; A为抗CEA McAb A1; B为抗AFP McAb G4; C为兔抗鼠IgG

4. 试剂条的测试操作 将试剂条包含样品垫的一端浸入标本中(勿超过MAX线的标志), 待标本上行至NC膜处取出, 平放。此时可以看到标本液体带动红色的金标抗体在吸水垫的虹吸作用下沿NC膜前移, 10 min(从待测标本上行至NC膜计时)时观察结果。试剂条A区出现的红色线条为CEA测定线, B区出现的红色线条为AFP测定线, C区出现的红色线条为质控线(此处点加了抗鼠IgG, 是对鼠McAb的非特异性反应), 表明试剂有效。

结 果
一、联合检测AFP和CEA GICA的建立

1. 最适工作条件的选择 经实验测试, 试剂条A区CEA测定线上抗CEA McAb A1溶液最佳点样浓度为2.0 mg/mL, B区AFP测定线上抗AFP McAb G4溶液最佳点样浓度为1.5 mg/mL, C区质控线兔抗鼠IgG溶液点样浓度为2.0 mg/mL, 敏感性可达到要求且背景清晰。

2. 检测结果判断 本试剂条采用的是双抗体夹心法原理。A区和B区测定线不显色表示相应的待测物阴性, 测定线显色则表示相应待测物为阳性(CEA> 10 μ g/L或/和AFP> 30 μ g/L)。具体测试结果判断法则:(1)仅C区质控线显色, 表示AFP含量< 30 μ g/L, CEA< 10 μ g/L; (2)C区质控线和A区测定线显色, 表示CEA> 10 μ g/L, AFP< 30 μ g/L; (3)C区质控线和B区测定线显色, 表示CEA< 10 μ g/L, AFP> 30 μ g/L; (4)C区质控线和A、B区测定线均显色, CEA> 10 μ g/L, AFP> 30 μ g/L; (5)C区质控线不显色, 表明试验无效。

3. 用配制的不同浓度的AFP、CEA标准液测试 测定结果见图2。

图2 不同浓度的AFP、CEA标准液的测定结果注:1为AFP 0 μ g/L、CEA 0 μ g/L; 2为AFP 0 μ g/L、CEA 10 μ g/L; 3为AFP 0 μ g/L、CEA 160 μ g/L; 4为AFP 30 μ g/L、CEA 0 μ g/L; 5为AFP 100 μ g/L、CEA 0 μ g/L; 6为AFP 300 μ g/L、CEA 0 μ g/L; 7为AFP 100 μ g/L、CEA 10 μ g/L; 8为AFP 300 μ g/L、CEA 160 μ g/L

二、联合检测AFP和CEA GICA试剂条的敏感性

用不同浓度的CEA标准液, 按测定步骤进行测定。CEA标准液10 μ g/L时, A区测定线开始有显色, 与阴性结果有明显区别; 该浓度测定10次, 每次测定线均显色, 且显色深浅基本一致, 故该GICA试条检测CEA的敏感性为10 μ g/L。同样实验发现, 检测AFP的敏感性为30 μ g/L。

三、联合检测AFP和CEA GICA试剂条的特异性

测定血红蛋白20 mg/L、人白蛋白100 mg/L、人球蛋白50 mg/L各3次, 测定线均无显色, 仅质控线显色, 结果呈阴性反应, 与血红蛋白、人白蛋白、人球蛋白均无交叉反应。

四、联合检测AFP和CEA GICA试剂条的干扰试验及基质效应

取3份含AFP 60 μ g/L、CEA 20 μ g/L的标准液, 分别等体积加入100 μ mol/L胆红素、15 mmol/L三酰甘油(TG)、2.0 mmol/L维生素C(Vit C)后进行测定, 测定线和质控线均能显色。说明其对高胆红素血、高脂血以及Vit C具有一定的抗干扰能力。另外, 取已知AFP、CEA浓度(2.1和1.5 μ g/L; 3.7和2.9 μ g/L)的2份临床血清标本各50 μ L, 第1份标本中仅加入100 μ g/L AFP 20 μ L, 另一份标本中加100 μ g/L AFP 50 μ L和80 μ g/L CEA 15 μ L, 此时2份标本AFP、CEA的终浓度分别为30.1、1.1和45.1、11.7 μ g/L, 用联合检测AFP和CEA GICA试剂条检测, 前者仅B区显色, 后者A、B区均显色, 说明该GICA试剂条基质效应不明显。

五、联合检测AFP和CEA GICA试剂条的精密度

用AFP标准液100 μ g/L和CEA标准液40 μ g/L按测定步骤进行测定, 各测定20次。每次测定线均显色, 且显色深浅基本一致, 说明GICA试剂条重复性符合要求。

六、钩状效应测试

用本试剂条检测AFP含量为1 000 μ g/L和7 200 μ g/L标准液以及10 000 μ g/L的标本时, B区测定线和质控线均显色。但检测AFP含量为10 000 μ g/L时测定线显色下降, 表示对高浓度AFP出现钩状效应, 此时质控线的显色也下降, 此强阳性结果有别于AFP< 100 μ g/L时质控线颜色明显深于测定线的弱阳性反应。另外, 测定CEA含量分别为160 μ g/L标准液以及500 μ g/L和1 000 μ g/L的血清标本时, A区CEA测定线均显色, 且逐渐加深, 表示CEA 1 000 μ g/L以内不会出现钩状效应。

七、稳定性试验

将本试剂条37 ℃中放置14 d和室温中放置6个月, 经检测发现, 试剂条的测定敏感性和其他性能指标均无明显改变。

八、临床标本测试

用本GICA试剂条测定了经DXI800酶微粒子化学发光仪定量测定AFP、CEA含量的临床血清标本共86份。GICA测定结果中, 除1份CEA(8.35 μ g/L)(+)应划入(-)、1份CEA (15.1 μ g/L)(-)应划入(+)外, 其余84份中CEA、AFP测定结果全部与定量测定范围符合, 符合率为97.7%, 见表1。

表1 临床标本化学发光法与联合检测AFP和CEA GICA测定结果比较
讨 论

简便化是临床检验的一大发展方向[6]。简便的GICA已广泛用于临床快速检验, 这也顺应了近年即时检验(point-of-care testing, POCT)快速发展的需求。目前商品化GICA试剂条一般测定单个分析物, 应用于检测血清肿瘤标志物, 临床应用价值往往有限。例如, AFP一直被认为是HCC较好的诊断指标, 但其阳性率也仅在60%左右; 美国HCC患者AFP阳性率仅为43%[7], 而且发现一些良性肝病患者AFP也会出现高值。因此以单一AFP作为HCC的肿瘤标志物容易造成HCC的漏诊和误诊。AFP和CEA的联合检测, 可提高恶性肿瘤的诊断性能, 而且对于判断HCC与转移性肝癌具有较好的应用价值, 对临床及时制订治疗方案具有一定的指导意义[8]。此外比较有意义的是, AFP和CEA也是体检中最常用的2种肿瘤标志物, 联合检测可提高多种肿瘤的检出, 同时使得操作大大简便。

我们研制了一种简便化的GICA试剂条, 可同时检测AFP和CEA。本试剂条选用的2对McAb在以前研究中发现他们的干扰效应甚微[3], 并且我们在本研究中进行了两者搭配的最佳点样浓度的摸索, 最后选定A区抗CEA McAb A1溶液最佳点样浓度为2.0 mg/mL, B区抗AFP McAb G4溶液最佳点样浓度为1.5 mg/mL。因为我国健康人群血清中AFP含量在30 μ g/L以下[9], CEA含量< 10 μ g/L, 故我们选定AFP含量> 30 μ g/L、CEA含量> 10 μ g/L判为阳性。实验结果表明, 本试剂条的敏感性达到了这一要求。用AFP和CEA参考标准品所做实验证明该试剂条能够测定AFP和CEA的含量; 与化学发光法对比测定临床标本符合性良好, 符合率达到97.7%(84/86)。不符合的2份标本化学发光法所测CEA结果(8.35和15.1 μ g/L)接近GICA所界定的临界值, 所有标本用本试剂条所测AFP结果与化学发光定量结果完全符合。对于AFP含量为10 000 μ g/L以及CEA含量为1 000 μ g/L的临床标本, 本试剂条均未出现钩状效应。综上表明, 本试剂条达到了临床测试要求。

目前多分析物的检测系统中, 常通过几种标记物的形式(每一种分析物对应一种标记物)来实现测定。然而多个标记物应用于一个测试中, 往往会因为他们之间检测最适条件的不一致而导致检测效能有所下降, 而且不同标记物之间结果信号的重叠干扰也给精确定量带来困难。所以, Fu等[10]使用了底物区带分辨技术来解决这一问题。另有Core Tech公司检测不同成分的毒品或肝炎病毒的产品, 通过一块反应板上进行几根试条的拼加(几个“ 检测窗” ), 共用一个加样孔, 可同时进行抗原和抗体检测。而我们的联合检测AFP和CEA GICA试剂条为非均相的固相膜免疫测定, 在标本通过NC膜时具有天然分区域免疫测定的优势, 巧妙地克服了这一问题。我们在A区和B区分别进行CEA和AFP检测, 实现了空间分辨, 即在同一条膜上(一个“ 检测窗” )同时检测多种物质。仅需50 μ L血清, 10 min后目测即能判读AFP、CEA的结果, 简便、快速, 成本较低, 可单个测试。在中小医院、基层诊所及边远地区, 可实现快速检测。

应用多种肿瘤标志物的联合检测可以有效提高恶性肿瘤诊断的敏感性, 而且在健康普查中特别适用。我们的研究主要是提供了一种测定模式, 在临床工作中可根据实际需要选择合适的指标进行联合检测。AFP和CEA作为临床上最常用肿瘤标志物, 在体检及肿瘤患者疗效监测中应用甚为广泛, 我们将进一步评价本试剂条的临床应用价值, 我们有理由相信这种简便、快速的测定方法有着良好的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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