引用本文
孙立山, 范列英, 张慧, 郑慧雅, 宗明, 朱海波. 测定GITR和GITRL ELISA的建立及其临床初步应用. 2009, 24(12): 891-894
SUN Lishan, FAN Lieying, ZHANG Hui, ZHENG Huiya, ZONG Ming, ZHU Haibo. The establishment of an ELISA for measuring GITR and GITRL and its clinical application. Labratory Medicine, 2009, 24(12): 891-894  
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测定GITR和GITRL ELISA的建立及其临床初步应用
孙立山, 范列英, 张慧, 郑慧雅, 宗明, 朱海波
同济大学附属上海市东方医院, 上海 200120

作者简介:孙立山,男,1978年生,硕士,技师,主要从事免疫学检验工作。

基金:上海市自然科学基金项目(05ZR14099); 浦东新区科技发展基金创新攻关项目(PKJ-2006-Y16)
摘要
目的

建立测定糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)及其配体(GITRL)的定量酶联免疫吸附试验(ELISA),并探讨GITR及GITRL定量测定在类风湿性关节炎(RA)及肿瘤疾病的诊断或病情监测中的临床应用。

方法

以鼠抗人GITR、GITRL单克隆抗体为包被抗体,以生物素-辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)检测系统,建立GITR和GITRL 定量检测的双抗体夹心ELISA。测定105例RA患者、54例肿瘤患者及100名健康体检者的血清GITR、GITRL含量,并探讨其与疾病的关系。

结果

建立的测定GITR、GITRL定量ELISA线性相关系数的平方( r2)分别为0.94和0.90。RA组血清中GITR、GITRL含量均明显高于正常对照组( P均<0.001);肿瘤组GITR高于正常对照组( P<0.001),GITRL与正常对照组差异无统计学意义( P>0.05)。

结论

本研究成功建立了GITR、GITRL定量ELISA,血清GITR、GITRL含量测定可能会成为RA新的辅助性诊断指标和病情监测指标。

关键词: 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体; 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体; 酶联免疫吸附试验; 类风湿性关节炎
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0891-04
The establishment of an ELISA for measuring GITR and GITRL and its clinical application
SUN Lishan, FAN Lieying, ZHANG Hui, ZHENG Huiya, ZONG Ming, ZHU Haibo
Shanghai Orient Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China
Abstract
Objective

To establish an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for measuring glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor(GITR)and glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand (GITRL), and explore the clinical application of the measurement of GITR and GITRL in the diagnosis and monitoring rheumatoid arthritis (RA) and tumor diseases.

Methods

With mouse monocolonal anti-human GITR and GITRL antibody as coating antibody and biotin-streptavidin-horseradish peroxidase (SA-HRP) as detecting system, a double antibodies sandwich ELISA was established for measuring GITR and GITRL. The serum levels of GITR and GITRL from 105 patients with RA, 54 patients with tumor and 100 healthy subjects were measured and the relationship of GITR and GITRL with RA and tumor diseases was analyzed.

Results

The correlation coefficient ( r2) was 0.94 for GITR assay and 0.90 for GITRL assay. The levels of GITR and GITRL in patients with RA were higher than those in healthy subjects ( P<0.001). The levels of GITR in patients with tumor were higher than those in healthy subjects ( P<0.001), and there was no significant difference for GITRL levels ( P>0.05).

Conclusions

An ELISA for measuring the GITR and GITRL in serum is successfully established. GITR and GITRL in serum may be new assistant diagnostic or monitoring parameters for RA.

Keyword: Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor; Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand; Enzyme-linked immunosorbent assay; Rheumatoid arthritis

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)是新近发现的一个共刺激分子, 由于其在CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞表面呈持续性高表达, 因此被视为Treg细胞的一个重要的表面标志, 受到广泛的关注[1, 2]。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(GITRL)表达于巨噬细胞和抗原提呈细胞(APCs)表面及血管内皮细胞表面[3]。APCs激活后GITRL表达量迅速短暂增加。GITRL与其受体结合后会促进T细胞的增殖活化, 抑制CD4+CD25+Treg细胞的功能。有研究表明, GITR、GITRL在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等的发病机制中起重要作用[4, 5]。我们拟建立GITR、GITRL定量酶联免疫吸附试验(ELISA), 并测定RA患者、肿瘤患者及健康体检者的血清GITR、GITRL含量, 以探讨GITR、GITRL检测的临床应用价值。

材料和方法
一、材料

1. 标本来源 (1)RA组:2005至2006年上海市东方医院门诊及住院RA患者105例, 符合1987年美国风湿病院RA诊断标准; (2)正常对照组:健康体检者100名; (3)肿瘤组:肿瘤患者54例。

2. 试剂和仪器 鼠抗人GITR单克隆抗体(MAB689)、鼠抗人GITRL单克隆抗体(MAB6941)、生物素标记的鼠抗人GITR单克隆抗体(BAF689)、生物素标记的鼠抗人GITRL单克隆抗体(BAF6942)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)、显色底物A液及B液、终止液、高吸附聚丙乙烯酶标板、基因工程重组人GITR和GITRL纯品(目前尚无统一的标准品, 以此纯品代替标准品)均购自美国R& D公司。酶标仪为Bio-Rod公司产品。

二、研究方法

1. 双抗体夹心ELISA检测步骤 在96孔ELISA板中, 每孔加入100 μ L适当浓度的捕获抗体, 密封后4 ℃过夜, 洗板, 加入含3%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)封闭。标本检测时, 每孔加入待检血清100 μ L, 置室温2 h, 洗板。将生物素标记的抗体稀释至适当的浓度, 每孔中加入100 μ L, 置室温2 h, 洗板3次。每孔中加入工作浓度SA-HRP 100 μ L, 室温孵育20 min, 洗板3次。加入底物液, 室温下避光放置20 min, 然后加入终止液, 混匀后测定每孔吸光度(A)450 nm值。

2. 包被用抗体浓度选择 将包被用鼠抗人GITR单克隆抗体及鼠抗人GITRL单克隆抗体以含0.1%BSA的PBS溶解后用PBS稀释, 配制成浓度为1、2、4 、8和16 μ g/mL的包被用抗体液, 用以上浓度包被液按上述方法进行包板。对高、中、低浓度标准品及PBS(作为空白对照)进行测定, 选取最佳包被用抗体浓度, 以空白对照A值最低且不同浓度标准品测定A值具有较好线性的抗体浓度作为确定的包被抗体浓度。

3. 标准曲线的绘制 将标准品按说明书所述方法溶解后, 以PBS进行倍比稀释, 配制成以下系列浓度的标准品:GITR浓度为32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 ng/mL, GITRL浓度为128、64、32、16、8、4、2和1 ng/mL。以所建立的方法对上述标准品进行检测, 以测得A450 nm值为横坐标, 以浓度的对数值为纵坐标, 绘制标准曲线。

4. 标本检测 以建立的ELISA分别测定RA组、正常对照组、肿瘤组各血清标本, 根据GITR、GITRL的标准曲线分别计算各标本的GITR、GITRL含量。

三、统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。标准曲线采用线性回归分析; 对RA组、正常对照组、肿瘤组测定结果分别进行正态性检验及统计分析。

结 果
一、包被用抗体浓度选择

抗GITR单克隆抗体最适包被浓度为4 μ g/mL, 抗GITRL单克隆抗体最适包被浓度为2 μ g/mL。

二、标准曲线

1. GITR标准曲线 本检测方法最低检测下限为0.25 ng/mL, 在0.25~32 ng/mL浓度范围内具有良好的线性。线性回归方程为LogY=0.609X+2.618, 相关系数的平方(r2)为0.94, 具有良好的相关性。标准曲线见图1。

图1 GITR检测标准曲线注:LogY=0.609X+2.618, r2=0.94

2. GITRL标准曲线 本检测方法最低检测下限为1 ng/mL, 在1~128 ng/mL范围内具有良好的线性。线性回归方程为LogY==0.685X+3.393, r2为0.90, 具有良好的相关性。标准曲线见图2。

图2 GITRL检测标准曲线注:LogY=0.685X+3.393, r2=0.90

三、RA组、正常对照组、肿瘤组标本检测结果

分别对3组数据进行正态性检验, P均< 0.001, 认为3组数据为非正态分布, 故对3组检测结果的统计性描述以中位数(范围)表示。对RA组与正常对照组、肿瘤组与正常对照组测定结果分别进行两独立样本Mann-Whitney U统计分析, RA组GITR、GITRL含量均高于正常对照组, 差异有统计学意义(P< 0.001); 肿瘤组GITR含量高于正常对照组, 而GITRL含量差异无统计学意义。见表1。

表1 RA组、正常对照组、肿瘤组GITR及GITRL含量的检测结果[中位数(范围)]
讨 论

目前对GITR、GITRL的研究主要集中于分子生物学水平和细胞水平, 国内外尚少有对人体血清中GITR、GITRL含量进行直接检测的研究报道。本研究尝试建立双抗体夹心ELISA对人体血清中GITR、GITRL进行定量检测, 并对RA患者、肿瘤患者体内GITR、GITRL进行测定。从本研究实验结果来看, 所建立的GITR、GITRL定量ELISA可以用于实验研究及临床GITR、GITRL检测。但该方法存在不足:由于目前国际上尚无统一的GITR、GITRL标准品供应, 本检测方法所采用的定量标准品是美国R& D公司生产的基因重组人GITR、GITRL纯品。因此应用不同公司生产的GITR、GITRL纯品作为定量标准品可能会存在较大差异。另外不同公司生产的抗人GITR、GITRL单克隆抗体因识别的抗原表位或抗体的效价不同, 可能会对检测结果造成不同程度的影响。

最近的研究表明, GITR、GITRL 参与炎性反应的发生包括反应早期的中性粒细胞和巨噬细胞的浸润及自身免疫或变态反应的病理生理过程。GITR、GITRL 参与的炎性反应的方式主要通过调节入侵过程、活化天然免疫细胞、活化效应性T细胞及部分抑制Treg细胞和树突状细胞的功能等[6]。GITR是CD4+ CD25+ T细胞增殖和早期激活的重要共刺激分子[1, 7, 8], Bae等[9]研究发现RA患者滑膜中的巨噬细胞表达GITR和GITRL, 而骨关节炎患者滑膜中巨噬细胞却不表达GIRL及GITRL, 并进一步证实了RA患者滑膜巨噬细胞表面表达的GITR通过促进细胞因子的表达和黏附, 促进RA患者滑膜巨噬细胞引起的炎性浸润。刘燕鹰等[10]研究发现, 在RA患者体内GITR的表达高于正常组及骨关节炎组, 且GITR和GITRL的表达同时增高, 两者相互作用, 可能使Treg细胞的功能受到影响, 可能与RA发病有关, 并认为GITR mRNA表达量可能与RA的疾病活动度有关。本研究通过对RA组、正常对照组、肿瘤组血清标本中GITR、GITRL定量检测, 发现RA组GITR和GITRL含量均明显高于对照组, 肿瘤组GITR含量也高于正常对照组, 但GITRL含量与正常对照组差异无统计学意义。对于GITR、GITRL检测, 3组中RA组升高最为明显。本研究结果与刘燕鹰等[10]对RA组、正常对照组GITR、GITRL mRNA表达量的研究结果相一致。王丽萍等[11]曾对37例RA患者滑液及血清中可溶性GITR(shGITR)水平进行检测, 结果显示RA患者滑液及血清中shGITR的水平明显较骨关节炎患者及正常对照组增高, 其结果与本研究的结果也相一致, 但其检测的GITR含量与本研究的检测结果存在较大差异, 可能是因为采用不同的检测方法所致, 尚待探讨。RA患者机体存在广泛的炎性细胞浸润, 大量活化的效应性T细胞表面高表达GITR, 细胞表面高表达的GITR脱落后, 释放入血, 故引起血清中GITR含量明显高于正常对照组。GITR、GITRL的含量可能会与人的免疫活性状态密切相关, 自身免疫性疾病患者体内GITR、GITRL含量会明显增高。本研究发现肿瘤患者血清中GITR含量较正常对照组略高, GITRL未见明显差异, 这可能与肿瘤患者存在免疫抑制状态有关, 还有待进一步证实。

目前对于自身免疫性疾病特异性的诊断指标已有很多, 但大部分指标测定结果的高低与疾病的严重程度、病情变化或治疗效果的显著与否并无明显相关性。因此尚缺乏与自身免疫性疾病病情变化及治疗效果明显相关的检测指标, 鉴于GITR、GITRL在免疫调节中的重要作用, 考虑其在体内含量及血清中含量可能与自身免疫性疾病病情相关[5, 6, 11], 探讨GITR、GITRL在不同自身免疫性疾病中含量变化及其与病情变化、治疗效果的相关性将是今后研究的重点。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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