引用本文
刘梦琼, 林永前, 王俏梅, 古升. 类风湿关节炎和系统性红斑狼疮患者血清基质金属蛋白酶2、9检测的意义. 2009, 24(12): 883-885
LIU Mengqiong, LIN Yongqian, WANG Qiaomei, GU Sheng. The significance of serum MMP-2 and MMP-9 levels and activities determination in patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Labratory Medicine, 2009, 24(12): 883-885  
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类风湿关节炎和系统性红斑狼疮患者血清基质金属蛋白酶2、9检测的意义
刘梦琼, 林永前, 王俏梅, 古升
海南省人民医院检验科,海南 海口 570311

作者简介:刘梦琼,女,1972年生,硕士,副主任技师,主要从事临床化学检验工作。

摘要
目的

探讨基质金属蛋白酶(MMPs) 在类风湿关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)中的重要作用。

方法

采用酶联免疫吸附试验和酶谱分析了48例RA和27例SLE患者及186例健康对照者血清中MMP-2和MMP-9的浓度和活性。

结果

酶谱分析结果显示RA和SLE患者血清MMP-2和MMP-9的活性显著高于对照组( P<0.01)。ELISA检测结果也表明RA、SLE组的MMP-2和MMP-9 浓度明显高于对照组( P<0.05)。

结论

MMP-2和MMP-9在RA和SLE患者血清中的水平及活性明显升高,表明MMPs在这些自身免疫疾病起一定的作用,可作为临床辅助诊断指标。

关键词: 基质金属蛋白酶-2; 基质金属蛋白酶-9; 类风湿性关节炎; 系统性红班狼疮
中图分类号:Q556 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0883-03
The significance of serum MMP-2 and MMP-9 levels and activities determination in patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus
LIU Mengqiong, LIN Yongqian, WANG Qiaomei, GU Sheng
Department of Clinical Laboratory, the People's Hospital of Hainan Province, Hainan Haikou 570311, China
Abstract
Objective

To investigate the importance of matrix metalloproteinases (MMPs) in rheumatoid arthritis (RA) and systemic lupus erythematosus (SLE) and determine the MMPs concentrations and activities in RA and SLE patients.

Methods

The levels and activities of MMP-2 and MMP-9 were detected in serum of 48 RA and 27 SLE patients and 186 healthy controls by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and zymography.

Results

The results of zymography showed that the activities of MMP-2 and MMP-9 in the RA and SLE patients were significantly higher than those of healthy controls( P<0.01). The results of ELISA also showed that the concentrations of MMP-2 and MMP-9 in the RA and SLE patients were significantly higher than those of healthy controls( P<0.05).

Conclusions

The results of MMP-2 and MMP-9 levels and activities significantly increase, which shows that MMPs plays an important role in these autoimmune diseases. They may become the auxiliary diagnose index in clinic.

Keyword: Matrix metalloproteinases-2; Matrix metalloproteinases-9; Rheumatoid arthritis; Systemic lupus erythematosus

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是依赖锌离子(Zn2+)的蛋白溶解酶家族, 在各种生理条件下对结缔组织的再构和细胞外基质的降解起重要作用, MMPs也与机体的病理状态相关, 如动脉粥样硬化、炎症、肿瘤生长和转移[1]。类风湿关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)是未知病因的自身免疫性疾病, 在这两类病中发现并鉴定了几个自身抗体, 如RA中的类风湿因子(RF)和SLE中的抗-双链DNA抗体。据报道MMPs系统参与RA的软骨和骨损伤以及SLE的外周神经病变, 但在这些研究中关于MMPs在RA和SLE中的作用存在差异。总之, 这些观察表明MMP-9在SLE疾病进展产生的炎症反应和组织损伤中有多重作用, 我们用酶谱分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA和SLE患者血清中的MMPs的活性和浓度, 了解其检测的意义。

材料和方法
一、研究对象

随机选择海南省人民医院2007至2008年内分泌科48例RA患者, 其中男12例, 女36例, 年龄32~72岁; 27例SLE患者均为海南省人民医院皮肤科住院患者, 其中男7例, 女20例, 年龄13~45岁。其诊断标准均符合1997美国风湿病协会标准。186名对照人群来自海南省人民医院体检普通人群, 男96名, 女90名, 年龄30~68岁。排除炎症及任何自身免疫病史, 体检正常, 无家族病史。

二、方法

1. 对MMP-2和MMP-9进行酶谱分析, 方法参照文献[2]。血清10倍稀释后, 用Bio-Rad蛋白定量试剂盒对稀释后的血清进行定量, 每个含20 μ g总蛋白的上样样本上样到10%明胶酶谱胶的上样孔中, 以已知MMPs浓度的健康个体作为对照标准。蛋白在浓缩胶中非还原条件下以15 mA开始分离, 然后在分离胶中电流增加到20 mA, 约1~1.5 h。电泳完后凝胶在2.5% Triton X-100中洗2次, 然后在含50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L CaCl2 和1 μ mol/L ZnCl2的底物中孵育过夜。用考马斯亮蓝R-250染色, 再用55%甲醇和7%醋酸混合液中脱色。可见凝胶普遍蓝染, 而底物被水解处呈透明带, 用OLYMPUS图像分析仪进行光密度测定。

2. 用ELISA检测血清MMP-2和MMP-9浓度。试剂购至美国R& D Systems公司。将MMP-2和MMP-9的血清稀释液100 μ L加到每个孔中, 然后加标准液及对照各50 μ L, 在震荡器上[(500± 50) r/min]室温孵育2 h, 吸出反应液, 用洗液洗4次。加200 μ L MMP-2或MMP-9的结合物到每孔中, 然后在振荡器上室温再孵育2 h, 甩干洗的步骤同上。加200 μ L底物, 暗室反应30 min, 加50 μ L终止液, 450 nm进行光密度检测。从标准曲线上求得每个样本的MMP-2和MMP-9的浓度, 共测定3次求平均值。MMP-2 和MMP-9的结果包含未活化的和活化的2种形式。MMP-2批内和批间CV分别为5.0% 和7.4 %, 最小检测剂量为0.15 μ g/L; MMP-9批内和批间CV分别为2.5% 和7.6 %, 最小检测剂量为0.153 μ g/L。根据试剂说明书, 无显著性的交叉反应或各种蛋白的干扰, 包括MMP-2和MMP-9之间的交叉反应。

三、统计学方法

所有数据采用SPSS15.0统计软件处理, 酶谱分析测得的光密度值进行t检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。ELISA检测血清MMP-2 和MMP-9浓度水平为偏态计量资料, 用中位数表示, 组间比较采用Wilcoxon-Mann-Whitney U检验, 显著性水平α =0.05。

结 果
一、MMP-2和MMP-9活性酶谱分析

RA组、SLE组的MMPs活性明显高于对照组(P< 0.01), 见图1、表1。

图1 各组血清中MMPs酶谱分析图

表1 各组血清MMP-2、MMP-9光密度值测定比较( x̅± s)
二、ELISA定量检测MMP-2和MMP-9的表达水平

对照组、RA和SLE组血清MMP-2、MMP-9水平见表2。RA组、SLE组的MMPs浓度明显高于对照组(P< 0.05)。

表2 ELISA测定各组MMP-2、MMP-9水平比较(μ g/L)
讨 论

MMPs是一类含有锌原子, 其活性依赖于钙原子的肽链内切酶, 大都以潜酶形式分泌。MMP-2和MMP-9是其中一大类, 又名明胶酶, 相对分子质量分别为72 000、95 000。由于其是构成细胞外基质(EMC)降解最重要的酶系统, 参与EMC的重塑、炎症反应、免疫应答等, 近几年成为研究热点。

本研究通过ELISA检测和酶谱分析的结果显示在RA和SLE患者血清中MMP-2和MMP-9的浓度和活性明显增加。这点与别的文献报道一致[3]。有研究表明RA关节液中MMP-9浓度和腺苷酸脱氨酶活性显著相关[4], 而且MMP-9活性的增加也与RA的临床活动呈正相关[5]。Makowski等[6]揭示MMP-9与抗-双链DNA呈负相关, 在抗体沉积在组织期间, 对监测SLE疾病的活动非常重要。本研究的缺陷是患者和对照的年龄不相匹配(对照组、RA和SLE患者的年龄分别为30~68岁、32~72岁和13~45岁)。有几个研究证明年龄不是影响MMP-2和MMP-9的水平的关键因素[7]。Derosa等[7]作了一个5年的随访, 发现尽管MMP-2和MMP-9在所研究的人群比对照有轻微的升高, 但增加的趋势没有显著意义。相应的, 年龄较大的患者应该比年轻的患者有较高的MMPs水平。因此, 年龄在各组之间并没有影响我们的研究结果的有效性, 特别对于SLE患者来说, 他们的年龄比对照组小得多, 但MMPs则高得多。此外, 除了用ELISA检查MMPs的表达水平, 本研究用酶谱分析对酶活性进行了检测, 血清中无活性的MMPs酶原在酶谱复性的步骤, 在明胶中完全激活。Kleiner等[8]发现酶谱分析是检查MMPs水平的精确方法, 当MMPs的量高于400 pg, 其活性才能被检测, 其表达量与其活性的比率为7:1。因此, 该实验不仅用于定量检测酶的总量, 而且还可检测酶量与活性的比例, 这使得酶谱不同于ELISA, ELISA不能分辨酶的活性和非活性形式[8]。而酶谱结果能够反应研究对象的MMPs活性, 通过研究MMPs的表达水平和活性, MMPs在RA和SLE中作用能较清楚地反映出来。

在正常的人体组织中, MMPs的表达较低, 但在一定的病理过程中其表达水平可升高。细胞外信号, 包括细胞因子、生长因子和直接的细胞与细胞之间的接触能瞬时刺激MMPs蛋白的合成[1]。SLE是自身免疫性疾病, 其特征以Th2细胞介导的体液免疫反应, RA则是以Th1细胞介导的细胞免疫反应。鉴定为什么这2种不同免疫反应的患者血清中MMP-2和MMP-9显著增加的机制是非常有意义的。一种可能的解释是:不管在RA或SLE中, 免疫反应过程中核转录因子(NF-κ B)组成式激活[1], 上调各种细胞因子的转录活性, 提高炎性反应的细胞因子接着刺激MMPs的表达和活性。但是, 这种解释需要进一步研究。

总之, RA和SLE患者血清中MMP-2和MMP-9的表达水平和活性显著升高, 因此MMPs蛋白在自身免疫性疾病中起一定的作用, 可做为该类疾病的一种辅助检测指标。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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