引用本文
张传宝, 张江涛, 张天娇, 周伟燕, 陈文祥, 申子瑜, 王冬环. 同位素稀释液相色谱串联质谱法测定人血清尿酸. 2009, 24(12): 878-882
ZHANG Chuanbao, ZHANG Jiangtao, ZHANG Tianjiao, ZHOU Weiyan, CHEN Wenxiang, SHEN Ziyu, WANG Donghuan. Determination of serum uric acid by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Labratory Medicine, 2009, 24(12): 878-882  
Permissions
Copyright©2009, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
同位素稀释液相色谱串联质谱法测定人血清尿酸
张传宝, 张江涛, 张天娇, 周伟燕, 陈文祥, 申子瑜, 王冬环
卫生部北京医院卫生部临床检验中心,北京 100730

作者简介:张传宝,男,1973年生,硕士,助理研究员,主要从事临床检验标准化研究。

通讯作者:王冬环,联系电话:010-58115059。

基金:国家科技支撑计划资助项目(2007BAI05B09); 国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006AA020909)
摘要
目的

建立一种使用同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)测定人血清尿酸的候选参考方法。

方法

用[1,3]-15N2尿酸作内标,与一定量的血清充分混匀,加入等量乙腈沉淀血清蛋白并提取尿酸,氯仿纯化上清液后用液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)分离测定。优化LC/MS/MS的色谱条件,评价该法的精密度、回收率和偏倚,并计算不确定度。

结果

对3个浓度水平的室间质量评价用质控血清测定3批,批内、批间和总变异系数( CV)的均值(范围)分别为0.54%(0.44%~0.69 %)、0.66%(0.45 %~0.79 %)和0.86%(0.66%~1.02 %)。加样回收试验回收率范围为98.38%~102.64%。美国国家标准与技术研究所(NIST)标准物质SRM 909b-Ⅰ、Ⅱ的测定均值与靶值的偏倚分别为0.04%和0.25%。3种质控血清的相对扩展不确定度分别为1.80%、2.19%和2.04%。

结论

建立的ID-LC/MS/MS测定血清尿酸的方法精密、准确,有望作为血清尿酸测定的参考方法。

关键词: 尿酸; 同位素标记; 液相色谱; 串联质谱法
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0878-05
Determination of serum uric acid by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry
ZHANG Chuanbao, ZHANG Jiangtao, ZHANG Tianjiao, ZHOU Weiyan, CHEN Wenxiang, SHEN Ziyu, WANG Donghuan
National Center for Clinical Laboratories, Beijing Hospital, Beijing 100730, China
Abstract
Objective

To develop a candidate reference method for the measurement of serum uric acid by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry (ID-LC/MS/MS).

Methods

An isotope labeled internal standard(IS) [1,3]-15N2 uric acid was weighed and spiked to serum samples. Acetonitrile was applied to precipitate serum proteins and extract uric acid and IS. After being treated with chloroform for further clean-up, the samples were analyzed by LC/MS/MS. Serum uric acid was quantified by a bracketing calibration.

Results

The within-run, between-run and total coefficients of variation( CV)of 3 batches of measurements of 3 levels of lyophilized sera used in external quality assessment ranged from 0.44% to 0.69%, 0.45 % to 0.79% and 0.66% to 1.02%, and the averages were 0.54%, 0.66% and 0.86%,respectively. The analytical recoveries ranged from 98.38% to 102.64% with an average of 100.55%. The results of analyzing the certified reference material SRM909b-Ⅰand Ⅱ showed 0.04% and 0.25% proportional bias compared with certified values. Evaluated uncertainty of measurement for the determination of 3 levels of lyophilized sera and values of the relative expanded uncertainty were 1.80%,2.19% and 2.04%.

Conclusions

An ID-LC/MS/MS method for measuring serum uric acid has been developed. The method is highly precise and accurate and may be used as a candidate reference method for serum uric acid measurement.

Keyword: Uric acid; Isotope dilution; Liquid chromatography; Mass spectrometry

人血清尿酸是嘌呤代谢的产物, 高尿酸血症可引起痛风、尿路结石等疾病。流行病学和临床研究证实, 尿酸浓度升高与高血压、冠心病和心力衰竭等心血管疾病的发生和死亡率密切相关[1, 2]。这些疾病的诊断和流行病学研究需要准确的尿酸测定结果。根据人血清尿酸的生物学变异, 尿酸检验的偏倚和总误差一般应小于5%和12%, 理想的情况应小于2.5%和6%[3]。提高和保证尿酸的分析质量需要可信赖的参考方法。国际医学实验室溯源联合委员会(JCTLM)列出的尿酸参考方法有德国临床化学会(DGKC)、美国国家标准与技术研究所(NIST)和Ghent大学的3种方法 [4~6] , 分析方法都是同位素稀释气相色谱质谱(ID/GC/MS)法。我国尚无尿酸参考方法。我们建立了一种基于同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)测定人血清尿酸的方法。

材料和方法
一、材料

1.化学试剂 尿酸标准物质SRM 913a购自美国NIST, 纯度99.6%± 0.1%。内标为[1, 3]-15N2尿酸(美国CIL公司), 丰度98%。乙腈(德国Merck公司), 氯仿(美国Tedia公司)为色谱纯。

2.样本 精密度评价样本为全国常规化学室间质量评价样本(冻干血清, 2~8 ℃保存), 批号分别是200731、200733、200735; 用浓度约为76.05 mg/L的新鲜血清评价回收率。方法准确性评价使用的是NIST标准物质SRM 909b(-70 ℃保存)。分析时按说明书以重量法复溶。

3.仪器 液相色谱串联质谱联用系统(LC/MS/MS), 包括Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、API 4000串联三重四极杆质谱仪和Analyst 1.4.2数据处理软件(美国Applied Biosystems公司)。涡旋振荡器(美国Glas-col公司); 血液混匀器(美国Fisher Scientific公司); 离心机(德国Sigma公司); 氮吹仪(美国Pierce公司)。德国Sarforius 电子天平BP110S和BP310S, 精度分别为0.1 mg和1 mg。

二、标准溶液和内标溶液的制备

1.100 mg/L标准溶液配制 精密称取0.010 4 g尿酸标准物质SRM 913a溶解于99.599 4 g的2 mmol/L的氨水中。该溶液浓度为0.104 4 mg/g。分装于2 mL安瓿瓶中, -20 ℃保存。

2. 100 mg/L内标溶液配制 精密称取0.007 1 g [1, 3]-15N2尿酸, 溶解于69.296 0 g的2 mmol/L的氨水。该溶液浓度为0.102 5 mg/g。分装于2 mL安瓿瓶中, -20 ℃保存。

三、标准和样本的制备

1.标准液与内标液的混合 分析每批血清样本需制备一对标准。用微量移液器取约81 μ L标准液, 称重得其精确质量。取90 μ L内标液, 称重得其精确质量, 加入标准液中, 轻轻振荡混匀。该混合液中尿酸与内标含量的比例约为0.9:1, 记为低标。按上述方法取约100 μ L标准液与90 μ L内标液混合, 该混合液中尿酸与内标含量的比例约为1:1, 记为高标。

2.血清样本与内标的混合 用酶法测定各种血清, 得到其尿酸的大概含量。用微量移液器取约70~400 μ L血清, 称重得其精确质量; 取90 μ L内标液, 称重得其精确质量, 加入血清中。使所取血清尿酸含量与[1, 3]-15N2尿酸的比例近似为1:1。加入适量0.01 mol/L磷酸盐缓冲液, 使终体积为0.4 mL, 轻轻混匀, 室温静置1 h平衡。

3.尿酸提取和净化 在各标准和样本管中加入等体积乙腈, 充分混匀沉淀血清蛋白并提取尿酸, 室温静置10 min, 以3 500 r/min(离心半径13 cm)离心10 min, 取上清, 高纯氮气吹干。残渣复溶于400 μ L的2 mmol/L氨水中, 加入500 μ L氯仿, 涡旋振荡10 s, 以3 500 r/min(离心半径13 cm)离心10 min。将水相移至2 mL样本瓶中进行LC/MS/MS分析。

四、LC/MS/MS分析和数据统计

1.色谱条件 色谱柱为Synergi Hydro-RP C18柱(2.0 mm× 150 mm, 粒径4 μ m, 美国Phenomenex公司)。流动相流速为0.2 mL/min, 进样体积为2 μ L。根据尿酸的性质和其他的实验报告[7], 选取了乙酸胺-乙酸缓冲液做为流动相, 考察和优化了不同流动相组成、pH值以及各质谱参数, 确定最终的LC/MS/MS分析条件。分别用纯水(pH值7.85)、5和10 mmol/L乙酸胺溶液(pH值6.85)及pH值分别为5.57、5.15、4.50的10 mmol/L乙酸胺溶液为流动相, 优化尿酸的色谱条件。

2.质谱条件 使用电喷雾电离源(ESI)负离子模式和多反应监测(MRM)模式分析, 尿酸和同位素内标检测的离子为质荷比(m/z) 166.9(Q1)→ 123.9(Q3)和m/z 168.9(Q1)→ 124.9(Q3)。雾化气(Gas1)、雾化辅助加热气(Gas2)、气帘气(CUR)和碰撞气(CAD)均为氮气。Gas1、Gas2、CUR 、CAD分别为70 psi、70 psi、10 psi和4 psi, Gas2加热温度为600 ℃。去簇电压(DP)、入口电压(EP)、出口电压(CXP)和喷雾电压(IS)分别为-60 V、-6 V、-8.5 V和4 500 V。碰撞能量(CE)为-22 V。

3.分析过程 每个样本与一对标准同一批测定。分析时以低标、样本、高标的次序进样, 每个样本或标准重复进样测定3次, 计算时以所得结果的均值作为一个有效数据。

4.数据处理 使用包括法计算血清尿酸浓度, 计算公式如下:

RWS=RWL+ (RIS-RIL)(RWH-RWl)RIH-RIL

式中S是血清样本, L和H分别是尿酸与同位素内标质量比值为0.9和1.1的2个标准溶液。RW是样本中尿酸与同位素内标质量比值, RI是样本中尿酸与同位素内标测量峰面积比值。通过下列公式计算得到尿酸的浓度, 单位是mg/L。

C= (RWS)(M* )MS(DS)× 103

式中RWS是按公式1计算的值, M* 是内标质量, MS 是血清样本质量。P是尿酸标准物质纯度, DS是血清密度, 取值为1.025 g/mL, NIST标准物质SRM909b-Ⅰ 和Ⅱ 的取值为1.022 1 g/mL和1.037 0 g/mL。

五、精密度和回收率评价

测定3种不同浓度的质控血清尿酸3批次, 每种血清重复测定3份, 考察方法精密度。配制330.5 mg/L的尿酸标准液, 溶剂为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。以浓度约为76.05 mg/L的新鲜血清为研究对象, 加入不同量的上述标准溶液后, 制成2种不同浓度的制备血清。3种浓度血清测定2次, 每次同一浓度血清重复测定3份。检测原血清浓度和2种加标制备血清浓度, 考察方法的回收率。

六、不确定度评定

分析该方法过程产生的不确定度来源及分量。称量氨水质量2次, 计入标准不确定度2次。合成各标准不确定度分量。取扩展因子2(95%置信区间), 计算精密度评价用的3种编号为200731、200733和200735质控血清的扩展不确定度。

结 果
一、LC/MS/MS分析条件的确定

pH值由7.85降低到4.50, 尿酸在Synergi Hydro- C18反相色谱柱的保留时间从1.528 min延迟到6.57 min, 色谱峰对称因子优化为0.96。选择10 mmol/L乙酸胺做流动相时, LC/MS/MS分析信号基线噪声小, 优于5 mmol/L乙酸胺。因此选择pH值为4.50的10 mmol/L乙酸胺溶液为流动相。

按优化的条件, 一级质谱全扫描负离子模式下采集的质谱图扣除溶液本底离子后如图1, 尿酸和同位素尿酸对应的基峰离子分别是[M-H]- 离子m/z 166.9和m/z 168.9。参考尿酸分子结构, 选择母离子为[M-H]-做二级质谱碎片离子扫描。对尿酸标准液、内标液以及混合溶液分别扫描并检查信号稳定性后, 分别选择子离子m/z 123.9和m/z 124.9为定量离子。尿酸二级质谱碎片离子全扫描模式采集到的尿酸质谱图如图2。二级质谱多反应模式(MRM)选择m/z 166.9(Q1)→ 123.9(Q3)和m/z 168.9(Q1)→ 124.9(Q3)进行定量分析, 子离子m/z 123.9和m/z 124.9的色谱图见图3。

图1 尿酸和内标一级全扫描质谱图

图2 尿酸[M-H]-离子(母离子)二级全扫描质谱图

图3 LC/MS/MS分析尿酸和内标色谱图

二、精密度

方法精密度见表1。批内、批间和总变异系数(CV)的均值(范围)分别为0.54%(0.44%~0.69 %)、0.66%(0.45 %~0.79 %)和0.86%(0.66%~1.02 %)。

表1 3批测定3种浓度血清尿酸精密度
三、回收率

2种浓度加标血清的平均回收率分别为100.99%(99.45%~102.64%)和100.10 % (98.38%~101.55%)。见表2。

表2 LC/MS/MS法测定血清尿酸的回收率
四、参考物质分析

用本法测定NIST标准物质SRM 909b-Ⅰ 、909b-Ⅱ 以评价本法的准确性, 结果见表3 。

表3 NIST SRM909b-Ⅰ 、Ⅱ 测定值与靶值的偏倚
五、不确定度评定

对本研究测定的3种质控血清进行不确定度评定。表4是编号200731质控血清的不确定度来源及数据分析表, 其他2种血清的不确定度来源与之相同。200731、200733和200735质控血清的相对扩展不确定度分别为1.80%、2.19%和2.04%(95%置信区间)。

表4 编号200731质控血清的不确定度来源及数据分析表
讨 论

人血清尿酸浓度与一些重要的疾病密切相关, 因此医学实验室的检测能力和方法性能会影响到这些疾病的诊断和治疗。卫生部临床检验中心的室间质量评价数据显示95%以上的参加实验室用酶法测定尿酸, 除去± 2s后, 实验室不同方法间的CV在3%~8%之间。建立参考方法和开展标准化计划是进一步提高这类项目检测的重要途径。

尿酸是稠环化合物, 不溶解于水和大多数有机溶剂, 可以溶解于碱性水溶液或酸性缓冲溶液。根据文献, 在尿酸参考方法中, Siekman等[4]使用的是尿酸的0.015 mol/L氨水溶液, 该溶液需要使用时新鲜配制。但根据Ellerbe等[5]对尿酸氨水溶液的稳定性研究显示, 0.015 mol/L氨水溶解的尿酸在1 h内就可以发生显著降解。因此, 用该标准液检测血清尿酸很难达到决定性方法的要求。实验证实, 当溶液中氨水与尿酸的摩尔质量比例大于3.4时, 至少有4种尿酸降解产物产生, 包括尿囊素和尿素[8]。我们使用2 mmol/L氨水制备标准溶液, 该浓度下氨水与尿酸摩尔质量比例小于1.7, -20 ℃至少可以稳定3个月。Stö ckl等[6]建立的方法为了实现标准液稳定, 使 (NH4)2 HPO4与尿酸的比例小于3。还有很多HPLC的方法使用碳酸锂水溶液配制标准液, 这些标准液的稳定性有待考察。

血清中加入内标后, 尿酸和内标是否充分平衡是影响检测准确性的因素之一。使血清和内标室温平衡10、20、40、60和120 min以及过夜, 尿酸和内标的比值没有差别, 本研究选择了平衡时间为60 min。样本制备时用乙腈沉淀蛋白, 与血清样本相同体积的乙腈可以达到98%以上的蛋白沉淀效率和95%以上的尿酸绝对回收率[9]。本研究也显示血清中加入乙腈, 涡旋混匀10 s即可达到最大的尿酸绝对回收率。血清中水相缓冲液可以与乙腈互溶。溶解度实验提示:提取尿酸到上清的溶剂因素是水相而不是乙腈。后续步骤用氯仿纯化上清液并离心, 进一步去除残留血清蛋白到氯仿层, 血清脂类也可以达到有效去除。气相色谱-质谱法(GC-MS)分析经该步骤纯化前后的血清, 某些单糖类也被有效去除。

尽管LS/MS/MS的MRM检测模式通过离子选择的特异性可以分析定量复杂成分样本, 但适当的样本纯化步骤仍然能够消除其他化合物离子碎片对目标化合物定量的影响, 并且可以保护色谱柱。传统的反相柱由于不适用完全水相的流动相, 分析尿酸时需要在缓冲液流动相中加入适当比例乙腈。而Synergi Hydro-RP C18柱适用于完全的缓冲液流动相, 并且改善了峰形。尿酸具有还原性, LC/MS/MS/MS电离模式采用负离子模式比较合适, 该模式得到[M-H]-。尽管一级质谱正离子模式得到了[M+H]+的离子峰, 但在碎片离子扫描时选择不到稳定的离子。尿酸和同位素内标在碰撞池的分解方式可能略有不同, 因此尽管尿酸和同位素内标摩尔质量相差两个质子数, 但选择的检测离子是m/z 123.9和m/z 124.9。定量方法采用的是包括法, 标准溶液和样本用称重法制备。

总之, 本研究建立了ID-LC/MS/MS测定血清尿酸的方法, 经一级和二级质谱选择负离子模式并优化测定条件后, MRM模式检测碎片离子, 以包括法定量。方法总CV为0.69%, 回收率98.38%~102.64%, 对参考物质的检测值符合认定值。方法精密可靠, 有望用作血清尿酸测定参考方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Erdogan D, Gullu H, Caliskan M, et al. Relationship of serum uric acid to measures of endothelial function and atherosclerosis in healthy adults[J]. Int J Clin Pract, 2005, 59(11): 1276-1282. [本文引用:1]
[2] Abate N, Chand alia M, Cabo-Chan AV Jr, et al. The metabolic syndrome and uric acid nephrolithiasis: novel features of renal manifestation of insulin resistance[J]. Kidney Int , 2004, 65(2): 386-392. [本文引用:1]
[3] Callum GF. Biological variation: from principles to practice [M]. Washington DC: AACC Press, 2001: 139-141. [本文引用:1]
[4] Siekmann L. Determination of uric acid in human serum by isotope dilution-mass spectrometry: definitive methods in clinical chemistry, Ⅲ[J]. J Clin Chem Clin Biochem, 1985, 23(3): 129-135. [本文引用:2]
[5] Ellerbe P, Cohen A, Welch MJ, et al. Determination of serum uric acid by isotope dilution mass spectrometry as a new cand idate definitive method[J]. Anal Chem, 1990, 62(20): 2173-2177. [本文引用:1]
[6] Stöckl D, Reinauer H. Cand idate reference methods for determining target values for cholesterol, creatinine, uric acid, and glucose in external quality assessment and internal accuracy control. I. method setup[J]. Clin Chem, 1993, 39(6): 993-1000. [本文引用:2]
[7] Dai XH, Fang X, Zhang CM, et al. Determination of serum uric acid using high-performance liquid chromatography(HPLC)/isotope dilution mass spectrometry(ID-MS) as a cand idate reference method[J]. J Chromatography B, 2007, 857(2): 287-295. [本文引用:1]
[8] Ellerbe P, Cohen A, Welch MJ, et al. The stability of uric acid in ammonium hydroxide[J]. Clin Chem, 1988, 34(11): 2280-2282. [本文引用:1]
[9] Sakuma R, Nishina T, Kitamura M. Deproteinizing methods evaluated for determination of uric acid in serum by reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detection[J]. Clin Chem, 1987, 33(8): 1427-1430. [本文引用:1]