引用本文
石瑛, 孙书明, 张婧婧, 王辉. 核糖体蛋白基因在胃肠道肿瘤中的表达. 2009, 24(12): 861-865
SHI Ying, SUN Shuming, ZHANG Jingjing, WANG Hui. Gene expression of ribosomal protein in gastroenteric tumor. Labratory Medicine, 2009, 24(12): 861-865  
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《检验医学》编辑部
核糖体蛋白基因在胃肠道肿瘤中的表达
石瑛1, 孙书明2, 张婧婧1, 王辉1
1.新乡医学院医学检验系 河南 新乡 453003
2. 新乡医学院免疫学研究中心 河南 新乡 453003

作者简介:石 瑛,女,1971年生,博士,讲师,主要从事肿瘤分子生物学和内分泌免疫学研究。

通讯作者:王 辉,联系电话:0373-5289291。

基金:教育部回国人员启动基金资助项目[教外司留2007(24)文]; 河南省科技厅资助项目(0524410050)
摘要
目的

探讨核糖体蛋白(RP)基因在胃肠道肿瘤中的表达。

方法

对NCBI网站中的基因表达系列分析(SAGE)数据库公布的80个癌和癌旁正常组织RP基因进行对比分析(包括结肠癌和胃癌)后,取胃癌、结肠癌标本各30例,通过逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)对RP L13(RPL13)、RPL37、RPS2和RPS19基因的表达进行检测。

结果

SAGE数据库分析表明: RPL13、RPL37、RPS19、RPS2和RPLP2在胃癌中表达比正常胃组织中表达平均分别高6.25、2.40、3.86、2.22和3.15倍,在结肠癌中的表达比正常结肠组织中表达平均分别高3.22、7.10、2.55、5.87和2.84倍;RT-PCR结果显示胃癌和结肠癌组织中RPL13、RPL37、RPS2和RPS19 mRNA的表达均高于正常组织( P<0.05)。

结论

胃肠道肿瘤中存在着共同高表达RP基因,这些共同高表达RP基因可能与消化道肿瘤的发生、发展密切相关。

关键词: 核糖体蛋白; 基因系列表达分析; 结肠癌; 胃癌
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0861-05
Gene expression of ribosomal protein in gastroenteric tumor
SHI Ying1, SUN Shuming2, ZHANG Jingjing1, WANG Hui1
1.Department of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, Henan Xinxiang 453003, China
2.The Research Center for Immunology, Xinxiang Medical University, Henan Xinxiang 453003, China
Abstract
Objective

To explore the gene expression of ribosomal protein (RP) in gastroenteric tumor.

Methods

80 samples of RP genes of carcinoma, including 30 samples of colon carcinoma and 30 samples of gastric carcinoma, and adjacent normal tissues in the serial analysis of gene expression (SAGE) library downloaded from NCBI website had a comparative analysis. From the analyzed data, RPL13, RPL37, RPS2 and RPS19 as candidate genes were selected. Those genes of 30 clinical samples of gastric carcinoma and colon carcinoma were determined respectively by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

Results

SAGE library data showed that the expressions of RPL13, RPL37, RPS19, RPS2 and RPLP2 genes in gastric carcinoma were 6.25, 2.40, 3.86, 2.22 and 3.15 times more than those in adjacent normal tissues, respectively; the expressions of these RP genes in colon carcinoma were 3.22, 7.10, 2.55, 5.87 and 2.84 times more than those in adjacent normal tissues. RT-PCR results showed that the expressions of RPL13, RPL37, RPS2 and RPS19 from 30 cases of gastric carcinoma and colon carcinoma were significantly higher than those from normal tissues respectively ( P<0.05).

Conclusions

Some high expressions of RP genes in gastroenteric tumor may have relationship with the genesis and development of gastroenteric tumor.

Keyword: Ribosomal protein; Serial analysis of gene expression; Colon carcinoma; Gastric carcinoma

核糖体蛋白(RP)是核糖体的主要组成成分, 通过促进核糖体核糖核酸(rRNA)折叠而使核糖体处于最有利于执行翻译功能的构象状态, 以此提高蛋白质生物合成的效率和准确度。RP还参与细胞增殖、分化和凋亡, 在生物体的生长、发育中起着关键性作用。越来越多的证据还表明核糖体还具有核糖体外功能。一些RP可以参与基因的复制、转录和机体发育的调控等功能, 同时也发现RP与正常细胞的恶性转化密切相关[1]。目前, 关于肿瘤组织中RP基因高表达的研究亦有报道, 但以往的研究手段主要是利用cDNA敲除、mRNA差异显示技术及EST(expressed sequence tag)技术对有限数量的RP基因进行筛选研究, 并且不能进行定量分析。NCBI网站中的基因表达系列分析(SAGE)数据库则是一种非常有效地、能从总体水平上对基因表达特征进行评价的一种新技术, 并能发现与疾病相关的新基因, 提供出量化的数据指标。

本研究中, 通过分析NCBI公布的80个胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌及相应正常组织的SAGE数据库, 发现结肠癌和胃癌的发生与RP基因高表达具有一定的相关性, 并通过临床标本对分析的结果进行验证。通过对胃肠道肿瘤中RP基因高表达的分析, 旨在为临床胃肠道肿瘤的诊断提供新的生物学标记, 为其治疗提供新的靶点。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象 30例胃癌组织及其配对癌旁正常组织、30例结肠癌组织及其配对癌旁正常组织均来源于2004年9月至2006年8月新乡市中心医院和新乡市第二医院手术切除标本, 配对癌旁正常组织至少距离癌组织边缘3 cm, 且标本均经病理学证实。患者术前均未接受放疗、化疗及其他治疗。胃癌患者中男18例, 女12例; 结肠癌患者中男21例, 女9例。

2. 主要试剂和仪器 RNA later样品储存液、dNTPs、 Taq酶等(北京天根公司); RNeasy Mini Kit(Qiagen公司); Omniscript RT Kit(Qiagen公司); 引物合成(北京赛百盛公司)。T1-96 PCR仪(德国Biometra); BioDoc凝胶成像系统(英国UVItec); 紫外分光光度计Biophometer(德国Eppendroff)。

二、方法

1. 分析 SAGE数据库 利用Microsoft Access软件将从NCBI网站(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/sage/obsolete/seq/) 下载的正常结肠黏膜组织GSM728、GSM729与结肠癌黏膜组织GSM682、GSM717、GSM747、GSM749、GSM755、GSM756基因SAGE数据库、正常胃黏膜组织GSM784与胃癌黏膜组织GSM2385、GSM757、GSM758、GSM7800、GSM8505、GSM8867、GSM9103、GSM9104基因SAGE数据库的标签(tag)与NCBI已知基因数据库的标签进行比较, 获取各种相对应的基因, 对正常组织与癌症组织数据库的所有RP基因进行分析, 获取各种组织核糖体基因表达的tag数。用Gene Cluster和Gene TreeView软件对正常组织与癌组织数据库的所有核糖体基因SAGE的tag进行作图分析。

2. 逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR) 各标本按RNeasy Mini Kit试剂盒说明书进行总RNA提取, RNA提取后通过紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测RNA浓度和质量。采用Primer 3.0软件, 根据NCBI网站上公布的各RP基因序列, 设计RP基因引物:RPL13基因上游引物序列:5'-GTTCGGTACCACACGAAGGT-3', 下游:5'-TGGG GAAGAGGATGAGTTTG-3'; RPL3上游引物序列为:5'-ATGACGAAGGGAACGTCATG-3', 下游:5'- TTAGCCTTGGCACTCCAGTT-3'; RPS2上游引物为:5'-CGTCGGTCTGGGTGTTAAGT-3', 下游:5'-TGAGCAGCTTCTTAGGCACA-3'; RPS19上游引物为:5'-AGACGTGAACCAGCAGGAGT-3', 下游:5'-TTCTCTGACGTCCCCCATAG-3'; 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物为:5'-TTAG CACCCCTGGCCAAGG-3', 下游为:5'-CTTACTCC TTGGAGGCCATG-3'。逆转录反应按照Omniscript RT Kit试剂盒说明书进行, 即总RNA 1 μ g, Oligo (d) T引物 (10 μ mol/L) 2.0 μ L, 10× Buffer 2.0 μ L, dNTPs(10 mmol/L)2.0 μ L, Omniscript逆转录酶 1.0 μ L, RNA酶抑制剂1.0 μ L, 用RNase free dH2O补齐至20 μ L, 37 ℃恒温水浴1 h, 所得cDNA -20 ℃保存备用。利用上述引物和逆转录的cDNA进行PCR扩增目的基因RPL13、RPL37、RPS2和RPS19, 以GAPDH为内参照。PCR反应体系为50 μ L, 即10× PCR buffer 5 μ L, 二甲基亚砜(DMSO) 3 μ L, dNTPs(10 μ mol/L)5 μ L, 核糖体上下游引物(100 μ mol/L)各2 μ L, GAPDH上下游引物(100 μ mol/L)各2 μ L, cDNA 1 μ L, Taq酶 1 μ L, 补dH2O至50 μ L。扩增条件为:95 ℃变性2 min, 循环周期依次为95 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 30个循环后72 ℃延伸5 min。PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳后在凝胶成像系统中进行观察、照相, 最后将电泳图片用凝胶图像处理软件Band Leader 3.0对条带进行灰度分析。

三、统计学方法

计算基因库中RP mRNA表达水平的相对量。计算公式为:RP mRNA表达水平的相对量=(各组织RP基因SAGE的Tag数-正常组织RP基因SAGE的Tag数)/正常组织RP基因SAGE的Tag数。各组织RP mRNA表达水平分别以Gene cluster和Gene Treeview软件进行处理并做图。RP基因RT-PCR产物电泳的灰度值除以内参照GAPDH产物电泳的灰度值, 将比值用SPSS 11.0统计软件处理, 皆采用 x̅± s表示, 两均数比较采用t检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、SAGE数据库分析

数据库分析结果见图1。通过对比分析正常结肠黏膜组织及结肠癌黏膜组织基因数据库RP基因的表达, 发现RPL13、RPL13a、RPL19、RPL3、RPL37、RPL18、RPLP2、RPS19、RPS2、RPS25在癌黏膜组织中表达均高于正常黏膜组织; RPL27、RPS15、RPS13在癌组织中表达均低于正常黏膜组织。分析正常胃黏膜组织及胃癌黏膜组织基因数据库RP基因的表达, 发现RPL10a、RPL13、RPL32、RPL35、RPL37、RPL38、RPLP2、RPS19、RPS2、RPS12在胃癌黏膜组织中表达均高于正常黏膜组织, RPL15、RPS15、RPS10在胃癌组织中表达均低于正常黏膜组织。

综合分析RP基因在胃癌、结肠癌及其相应正常组织中的表达情况, 发现RPL13、RPL37、RPS19、RPS2和RPLP2在胃癌中比相应正常癌旁组织平均分别高6.25、2.40、3.86、2.22和3.15倍, 在结肠癌中的表达比相应正常癌旁组织平均分别高3.22、7.10、2.55、5.87和2.84倍。因此, 本研究利用RT-PCR的方法扩增胃癌和结肠癌中都高表达的RPL13、RPL37、RPS2和RPS19基因片段, 进一步验证上述数据分析的结果。

二、RP RPL13、RPL37、RPS2和RPS19 mRNA在胃癌中的表达

RP基因扩增结果见图2, 灰度分析结果见表1。对RP基因电泳条带灰度值进行分析表明:胃癌和结肠癌组织中RPL13、RPL37、RPS2和RPS19 mRNA的表达均高于相应的正常癌旁组织(P< 0.05或P< 0.01), 验证结果与SAGE数据库分析结果一致。

图1 结肠和胃组织SAGE数据库中RP基因的表达注:(a)为结肠癌与正常结肠组织; (b)为胃癌与正常胃组织。其中N为正常组织, M为癌组织; 根据图例灰度值判定癌组织与正常组织标签数的比值

图2 RT-PCR检测几种RP基因在胃癌与正常胃组织中的表达状况注:图(a)为胃癌RPL13电泳图; 图(b)为胃癌RPL37电泳图; 图(c)为胃癌RPS2电泳图; 图(d)为胃癌RPS19电泳图; 电泳图中N为正常组织, C为癌症组织, M为Marker

表1 RP基因在结肠癌和胃癌组织中的表达
讨 论

RP是组成核糖体的主要成分, 在正常生长条件下, RP与rRNA按化学计量协调一致的产生以合成等克分子量的核糖体, 执行蛋白质的生物合成功能, 赋予细胞或个体一定的功能或形态表型, 适应环境并维持个体发育和分化。

本研究分别分析比较了SAGE数据库中胃癌和结肠癌RP基因的表达情况, 发现在结肠癌、胃癌与其相应的配对癌旁正常组织中的RP基因表达具有一定的一致性。在结肠癌、胃癌中均存在共同高表达的RP基因:RPL13、RPL37、RPS2、RPS19、RPLP2。因此, 本研究中取临床标本对RPL13、RPL37、RPS2、RPS19基因进行RT-PCR检测, 结果证实RPL13、RPL37、RPS2、RPS19在胃癌、结肠癌中均高表达(P< 0.05或P< 0.01)。提示胃肠道肿瘤中存在共同高表达的RP基因, 这些高表达的RP基因可能与消化道肿瘤的发生、发展密切相关。

核糖体是蛋白质的加工厂, RP本身的表达水平可在一定程度上反映细胞生长的状态。无论正常组织或肿瘤组织, 总核糖体合成增多是细胞增殖活跃的常见特征。处于生长状态的细胞比静止细胞具有更有效的翻译RP mRNA的能力, 因此增殖活跃的细胞往往RP水平也会相应增高。然而, 某一种或某一亚组RP基因表达发生独立的、与rRNA生成不一致的增多的时候, 可能意味着具有潜在的核糖体外功能, 即与细胞增殖和蛋白质合成没有直接的关系的一些作用[2]。已有研究发现在肿瘤早期RP的合成增多现象就已经出现, 说明某种或亚型RP表达与rRNA数量的不平衡与肿瘤的起源伴行。目前认为核糖体在生长旺盛或者癌细胞中过表达有如下推测:第一, RP受翻译及翻译后水平调控, 有更多核糖体的细胞翻译速度加快。因此, 推测RP表达改变可能与其改变翻译的完整性有关。RPS2属于哺乳动物中高度保守的重复性看家基因, S2蛋白定位在40S核糖体亚单位的外膜上[3], 其与特异的大量的polyA+RNA杂交, 参与氨基酰tRNA与核糖体的连接, 潜在影响了mRNA翻译的准确性[4]。在人类鳞状细胞癌标本和细胞系的一个亚组、乳腺癌和结肠癌标本中均已观察到RPS2的过表达[5], RPS2在由ras、SV-40、多瘤病毒、劳斯伯瘤病毒、Abelson鼠白血病病毒和化学致瘤因子转变的致瘤细胞系中的表达水平高于其在非致瘤细胞系中的表达。推测RPS2过表达可能与细胞的表现型转化有关。研究发现RPS2在增殖的肝细胞中过表达, 提示RPS2基因转录和其相应的蛋白产品的增多反映活跃的细胞增殖, 而不是直接导致肿瘤的产生。第二, Loging等[6]在P53突变的细胞内证实了RPL37、RPS2、RPP-1 3种基因表达的增高。野生型P53蛋白是一种DNA连接转录因子, 在DNA损伤时激活P21、MDM2、GADD45和Bax基因维持细胞周期进行或凋亡, P53的突变形式正在转变为致瘤基因, 在许多肿瘤中高表达。P53突变不影响蛋白质的结构而影响DNA的连接, 并且P53突变可引起表现型转化, 以导致肿瘤的发生。在P53突变的细胞系中, 发现了3种RP基因RPL37、RPS2、RPP-1的过表达, 而且在P53突变存在的何杰金氏淋巴瘤及结肠癌中也发现了RPL37、RPS2、RPP-1的过表达。他们提出:这些RP基因表达的改变直接或间接与P53突变有关。因此, 这些RP基因的表达可能与转化的表现型有关。第三, RP基因高表达的抗凋亡作用。凋亡的抑制是导致肿瘤发生的一个因素, 研究发现RP基因过表达时引起抗凋亡蛋白上调, 抑制细胞的程序性死亡; 在结肠癌细胞系中发现RP基因过表达抑制肿瘤细胞的凋亡[7]。而本研究结果也显示了在胃癌、结肠癌中, RP RPL13、RPL37、RPS2、RPS19 mRNA表达均明显高于相应的正常的癌旁组织。

目前, 随着人们对RP基因过表达在肿瘤发生、发展中的作用的研究, 其作为肿瘤诊断和治疗靶点的作用已初露端倪。临床试验显示, 通过抑制RP基因的高表达可以控制癌细胞对化疗药物的反应[8]、促进凋亡的发生。另外, 由于大环内酯类药物雷帕霉素可以作用于翻译过程, 其在临床试验中具有较强的抗癌效果[9]。因此, RP基因RPL13、RPL37、RPS19、RPS2在胃肠道肿瘤中共同高表达及其与正常配对组织中表达差异的研究使RP基因RPL13、RPL37、RPS19、RPS2可能成为协助胃肠道肿瘤诊断、判断预后和疗效评价的一个重要指标。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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