引用本文
项明洁, 倪培华, 刘锦燕, 张华, 陈华, 倪语星. ERG11基因突变与白念珠菌对氟康唑耐药性的初步研究. 2009, 24(12): 856-860
XIANG Mingjie, NI Peihua, LIU Jinyan, ZHANG Hua, CHEN Hua, NI Yuxing. Research on ERG11 gene mutations in Candida albicans resistance to fluconazole . Labratory Medicine, 2009, 24(12): 856-860  
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《检验医学》编辑部
ERG11基因突变与白念珠菌对氟康唑耐药性的初步研究
项明洁1, 倪培华2, 刘锦燕1, 张华1, 陈华1, 倪语星3
1.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海 200020
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系,上海 200025
3. 上海交通大学医学院附属瑞金医院微生物科,上海 200025

作者简介:项明洁,女,1967年生,硕士,主任技师,主要从事临床微生物与免疫学检验、教学和科研工作。

基金:上海市卫生局科技发展基金资助项目(054118); 卢湾区卫生系统学科带头人培养计划资助项目(200501)
摘要
目的

探讨白念珠菌氟康唑作用的靶酶编码基因(ERG11)突变与氟康唑耐药性的关系。

方法

采用聚合酶链反应(PCR)扩增临床分离的23株白念珠菌ERG11基因,包括2株耐氟康唑株、9株氟康唑剂量依赖敏感株和12株氟康唑敏感株,并进行双向测序。应用Blast软件,将测序结果与网上已发表序列(GenBank AY856352)进行比对,以确定是否发生基因突变。

结果

23株白念珠菌的ERG11基因序列共检出16个同义突变位点和18个错义突变位点。错义突变中Y205E、I437V、A255V、E260V、K487N、G472R、N435V、D502E、K143Q为新发现的突变位点。

结论

Y205E、I437V、A255V位点突变发现于敏感株,可能与白念珠菌耐药无关;K487N、G472R、N435V、D502E、E260V发现于剂量依赖敏感株,K143Q发现于耐药株,可能与耐药的形成有关。

关键词: 白念珠菌; ERG11基因; 耐药性; 氟康唑; 基因突变
中图分类号:R379.4 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)12-0856-05
Research on ERG11 gene mutations in Candida albicans resistance to fluconazole
XIANG Mingjie1, NI Peihua2, LIU Jinyan1, ZHANG Hua1, CHEN Hua1, NI Yuxing3
1. Radioimmunology and Clinical Laboratory, Luwan Branch, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200020, China
2.Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025, China
3.Department of Clinical Microbiology Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To study the relationship between fluconazole-resistance of Candida albicans and the mutation of ERG11 gene encoding fluconazole-targeted enzyme.

Methods

The genes of 23 strains Candida albicans isolated from patients, including 2 strains of fluconazole-resistance, 9 strains of fluconazole-susceptible dose dependent and 12 strains of fluconazole-susceptible, were amplified by polymerase chain reaction(PCR) and bilaterally sequenced. The sequencing results were analyzed by Blast and compared with published sequence (GenBank AY856352) to find out the locations of mutation.

Results

16 silent mutations and 18 missense mutations were identified in 23 Candida albicans isolates. Among the missense mutations, Y205E, I437V, A255V, E260V, K487N, G472R, N435V, D502E and K143Q had not been found yet in the previous studies.

Conclusions

Resistant mechanism of Candida albicans to fluconazole may be correlated with the mutations of K487N, G472R, N435V, D502E, E260V and K143Q in ERG11 gene which existed in fluconazole-susceptible dose dependent and fluconazole-resistance isolates, but not with mutations of Y205E, I437V and A255V which existed in fluconazole-susceptible isolates.

Keyword: Candida albicans; ERG11 gene; Resistance; Fluconazole; Gene mutation

白念珠菌(Candida albicans)是临床最常见的条件致病性真菌, 在免疫力低下的患者(如器官移植、获得性免疫缺陷综合征、肿瘤化疗、长期使用大量广谱抗菌药物等)中容易引发感染, 导致鹅口疮、念珠菌阴道炎、念珠菌血症等。在临床治疗过程中, 氟康唑因其广谱、高效、良好的生物利用度和安全性被广泛应用。但由于其预防、经验或不规则治疗的频繁用药, 造成耐药菌株不断出现, 白念珠菌对氟康唑耐药率由20世纪90年代初期的< 1%上升到目前的5%[1], 给这类真菌感染性疾病的防治带来极大困难。因而从基因水平研究白念珠菌对氟康唑的耐药机制, 可以为耐药株的检测和治疗提供依据。在白念珠菌耐唑类药物的机制中, 对ERG11基因突变的研究是热点之一, 很多错义突变与耐药性之间的关系尚不明确[2]。我们通过肉汤微量稀释法测定氟康唑对白念珠菌临床分离株的最低抑菌浓度(MIC), 确定菌株的药物敏感性; 扩增11株氟康唑敏感性下降的白念珠菌临床株(包括2株耐药株和9株剂量依赖敏感株)和12株敏感株ERG11基因, 并全长测序, 筛查突变, 分析突变与菌株耐药性形成之间的关系。

材料和方法
一、材料

1. 实验菌株 23株临床分离白念珠菌菌株从上海交通大学医学院附属瑞金医院、瑞金医院卢湾分院、仁济医院、上海第一妇婴保健院、复旦大学医学院附属华山医院住院患者呼吸道、尿道、生殖道分泌物等标本中分离。均采用法国生物梅里埃公司API/ATB半自动微生物鉴定系统加以鉴定。2株质控株:白念珠菌(ATCC 90028, 氟康唑敏感株), 近平滑念珠菌(ATCC 22019, 氟康唑敏感株)。

2. 主要试剂与仪器 UNIQ柱式细菌基因组抽提试剂盒购自上海生工公司; 聚合酶链反应(PCR)试剂盒包括Taq酶、dNTP混合液等购自上海普洛麦格公司; PCR引物委托上海英骏生物技术有限公司合成; 双向测序由上海英骏生物技术有限公司完成。PCR扩增仪(杭州博日公司)、Centrifuge 5417R低温高速离心机(Eppendorf, 德国)、紫外凝胶成像系统(VILBER MLOURMAT, 法国)、Power PAC 200型电泳仪(Bio-RAD, 美国)。

二、方法

1. 药物敏感性测定 采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)M27-A2微量稀释法方案[3]测定23株临床白念珠菌菌株的MIC。以氟康唑抑制80%白念珠菌生长最低药物浓度为MIC, 同时采用近平滑念珠菌(ATCC 22019)和白念珠菌(ATCC 90028)为参照菌株。判读标准:MIC≤ 8 μ g/mL为敏感(S), 16~32 μ g/mL为剂量依赖敏感(SDD), ≥ 64 μ g/mL为耐药(R)。药敏试验重复3次。

2. 白念珠菌DNA的提取 严格按UNIQ柱式细菌基因组抽提试剂盒说明书对23株临床分离株和1株质控株白念珠菌(ATCC 90028)提取基因组DNA。

3. 白念珠菌ERG11基因的扩增 (1)引物设计:根据GenBank数据库收录的白念珠菌ERG11基因序列信息, 以基因文库登录号AY856352为已知序列设定引物2对, 见表1; (2)PCR反应参数(2对引物反应参数一样):先95 ℃ 预变性5 min, 然后进入循环, 变性95 ℃ 40 s、退火55 ℃ 40 s、延伸72 ℃ 90 s, 共35次循环, 最后72 ℃ 延长至5 min、4 ℃ 1 min。PCR反应体系总体积为25 μ L:TaqDNA酶(1 U/μ L)1 μ L, 10× PCR 缓冲液2.5 μ L, dNTP Mixture(25 mmol/L)0.2 μ L, DNA模板(200 ng)4 μ L, 上下游引物(50 μ mol/L)各0.2 μ L, 再加入蒸馏水和石蜡油。PCR产物用2%凝胶电泳, 溴化乙锭(EB)染色, 紫外灯下观察并用凝胶图像分析仪记录。

4. PCR产物的纯化和测序分析 PCR产物纯化, 并由上海英骏生物技术有限公司测序仪进行测序。使用Blast分析软件, 将扩增产物的基因序列与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的已知序列(AY856352)的ERG11基因对比分析, 以确定基因突变位点。Blast分析软件为GenBank数据库提供的BlastTn。每株临床菌株ERG11基因测序重复2次, 均做双向测序。

表1 ERG11基因PCR设计引物
结 果
一、药敏结果

23株临床分离的菌株中, 2株菌株MIC> 256 μ g/mL, 为耐药菌株; 9株菌株MIC为16或32 μ g/mL, 为剂量依赖敏感菌株; 12株菌株MIC为0.125或0.25 μ g/mL, 标准菌株白念珠菌(ATCC 90028)的MIC为0.25~1.00 μ g/mL, 标准菌株近平滑念珠菌(ATCC 22019)的MIC为2.0~8.0 μ g/mL, 均为敏感菌株。

二、PCR扩增结果

以23株临床分离的白念珠菌和标准菌株白念珠菌(ATCC 90028)的DNA为模板, 分别用2对引物进行PCR扩增, 全部菌株均获得了815和833 bp产物, 大小与DNA Maker比较, 位置相符, 无非特异性产物带, 见图1。

图1 ERG11基因815和833 bp片段凝胶电泳图注:M为Marker; 1为白念珠菌(ATCC 90028)P1片段; 2为白念珠菌(ATCC 90028)P2 片段; 3为菌株 P1 片段; 4为菌株 P2片段

三、PCR产物测序结果

11株临床分离的氟康唑敏感性下降白念珠菌菌株及12株敏感株测序均发现ERG11基因突变, 但突变位点不完全相同, 且存在一定数量的同义突变位点。12株敏感株发生了15个同义突变和5个错义突变; 2株耐药株和9株剂量依赖敏感株共发生了9个同义突变和16个错义突变。敏感株中出现的错义突变有D116E、Y205E、I437V、A255V、E266D; 耐药株和剂量依赖敏感株中出现的错义突变有A114S、Y257H、Y205E、Y132H、I437V、G448E、K487N、K128T、K143R、G472R、N435V、D502E、Y132F、K143Q、D116E、E260V, 其中K487N、G472R、N435V、D502E、E260V和K143Q是在氟康唑敏感性下降的菌株中新发现的突变位点, 见表2。

表2 白念珠菌各菌株ERG11基因位点和密码子变化
讨 论

白念珠菌产生耐药的原因较为复杂, 其耐药机制主要与基因突变、基因过度表达、细胞壁组成改变和生物被膜形成等有关[4]。但已有实验显示仅靶酶基因单个突变就可引起白念珠菌对氟康唑敏感性下降。ERG11基因(亦称为ERG16或CYP51A1基因)编码的蛋白质是氮唑类药物作用的靶酶, 即羊毛固醇14-α 去甲基化酶(14-DM), 该酶由528个氨基酸组成, 是一种细胞色素P-450酶, 为真菌细胞膜麦角固醇合成途径中的关键酶, 对维持细胞膜的正常结构和功能具有重要意义。ERG11基因突变可导致所编码的氨基酸改变, 使Erg11P结构改变, 从而影响了酶与药物的亲和力, 产生耐药[5]。

本研究从各大医院收集耐氟康唑的临床白念珠菌菌株, 发现临床白念珠菌对氟康唑仍有较高的敏感性。此外各大医院用纸片扩散法或ATB FUNGUS3药敏试验方法检测出的几十株耐药株, 用肉汤微量稀释法检测后, 仅2株确证为耐药株, 即MIC> 64 μ g/mL; 剂量依赖敏感菌株相对较多, 为9株, 即敏感性有所下降; 其余的为敏感株。纸片法或ATB FUNGUS3和肉汤微量稀释法药敏结果有一定的差异性, 因此耐药菌株的筛选还需用肉汤稀释法来确证。而目前实验室内普遍使用的抗真菌药敏试验, 其规范化急需得到重视。

本研究首先合成2对引物, 对23株临床分离的白念珠菌ERG11基因全长扩增, 再通过基因测序来分析ERG11基因突变情况, 初步研究白念珠菌对氟康唑的耐药机制。白念珠菌ERG11基因已知的错义突变有近70处, 其中已明确证实Y132H、T315A、S405F、G464S、R467K、I471T变异与念珠菌临床耐药有关, Y132H和S405F、Y132H和R467K点突变组合可能与其高水平耐药有关[2]。本次研究测序结果发现白念珠菌ERG11基因点突变比较常见, 共有16个同义突变和18个错义突变, 相比较而言耐药株和剂量依赖敏感株的错义突变多于敏感株。

错义突变中, D116E及新发现的Y205E、I437V在敏感株与耐药株中发生的频率很高。在第348 bp位点、第383 bp位点、第798 bp位点发生的D116E、K128T、E266D变异已被Marichal等[6]研究证实与白念珠菌耐药无关。敏感株中发生的Y205E、I437V、A255V变异为新发现, 可能与白念珠菌耐药无关。有12个错义突变仅出现于敏感性下降临床菌株, 其中有6个为新发现的位点变异, 即K487N变异出现于2株剂量依赖敏感菌株, G472R、N435V、D502E、E260V变异分别出现于1株剂量依赖敏感菌株, K143Q出现于2株耐药菌株, 这6个新发现的位点变异可能与耐药发生相关, 需进一步加以证实。G448E、K143R、A114S、Y257H、Y132F位点变化, 已在其他文献的耐药株中报道[6~11], 但这些位点变化与耐药的相关性尚未证实。至于Y132H突变位点, 虽然Sanglard等[7]通过定点突变证实其与耐药有关, 但Bellamine等[12]关于Y132H突变的研究结果与之不同, 该突变位点对氟康唑耐药的机制中究竟有何作用似乎还需进一步研究。此外, 本研究还发现2株剂量依赖敏感菌株均同时发生A114S、Y257H变异, 该现象也发现于Xu等[11]研究的耐药株中; 4株剂量依赖敏感菌株均同时发生Y132H、G448E变异; 2株耐药株均同时发生Y132F、K143Q变异, 这些点突变组合对药物和靶酶亲和力的影响可能存在协同性。

药物敏感株和耐药株同义位点的突变也不完全相同, 对基因表达有无影响, 可深入做mRNA测定, 探讨突变位点与耐药的关系。

本研究所发现的这些可能与耐药形成相关的错义突变, 可以采用计算机模拟构建的Erg11P三维模型, 了解氨基酸置换与氟康唑亲和力改变的机制。此外, 进一步研究基因突变与耐药性产生有无关联, 还需通过定点突变的研究方法, 从功能性表达入手。将以上包含ERG11基因点突变的开放读码框序列克隆后转入酒酿酵母表达系统, 通过耐药表型的检测和蛋白分析, 来阐明点突变与耐药间的关系, 如证实是哪个氨基酸置换引起白念珠菌对氟康唑产生耐药, 了解不同氨基酸置换对耐药的发生是否有协同性。

The authors have declared that no competing interests exist.

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