引用本文
欧元祝, 居漪. 三种临床血清酶国际、国内实验室比对结果分析及其参考方法的评估. 2009, 24(10): 737-741
OU Yuanzhu, JU Yi. Analysis of the international and domestic RELA results of three enzymes and evaluation of their reference methods. Labratory Medicine, 2009, 24(10): 737-741  
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三种临床血清酶国际、国内实验室比对结果分析及其参考方法的评估
欧元祝, 居漪
上海市临床检验中心,上海 200126

作者简介:欧元祝,女,1975年生,硕士,主管技师,主要从事临床生化参考体系标准化工作。

摘要
目的

分析2006年度至2007年度连续2年参加国际临床化学联合会(IFCC)的参考实验室丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的室间质评(RELA)结果及卫生部临床检验标准委员会(以下简称卫生部)的酶学室间比对结果,评估其所用测定参考方法的检测质量及其完善程度。

方法

根据IFCC公布的ALT、AST、LDH的测定参考方法的标准操作程序(SOP)进行测定, 根据《分析测量中不确定度的量化》(QUAM 2000)计算合成标准不确定度,用日本临床检验标准协议会(JCCLS)旭化成株式会社认证酶标准物质评估参考方法的分析性能(准确度与不精密度)。

结果

2006年度的国际RELA与卫生部酶学室间比对结果室内变异系数( CV)均在1.5%~2.1%, 2007年度的国际RELA结果与卫生部酶学室间比对结果室内 CV均在1.1%以下,且本实验室与总体均值的偏倚整体低于2006年度,除2006年度卫生部酶学室间比对结果有3个值与总体均值的偏倚(7.99%,-7.02%,-13.97%)超过允许偏倚外,其余值均在允许偏倚范围内。ALT、AST、LDH标准物质室内 CV均在1%以下,且均值偏倚靶值均低于1%。

结论

本实验室所用测定ALT、AST、LDH的参考方法已比较成熟稳定,2007年度的实验室比对结果优于2006年度。

关键词: 丙氨酸氨基转移酶; 天门冬氨酸氨基转移酶; 乳酸脱氢酶; 参考方法
中图分类号:Q555 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)10-0737-05
Analysis of the international and domestic RELA results of three enzymes and evaluation of their reference methods
OU Yuanzhu, JU Yi
Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai 200126, China
Abstract
Objective

To analyze the results of three enzymes[alanine aminotransferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH)] in the ring trials of Reference Laboratories In Medicine (RELA) organized by International Federation of Clinical Chemistry(IFCC) and the ring trials organized by National Center for Clinical Laboratory (NCCL) in 2006 and 2007, and evaluate the analytic characteristic and reliability of the reference methods of ALT,AST and LDH.

Methods

ALT, AST, and LDH were measured by the standard operating procedure (SOP) of reference methods published by IFCC, and the combined standard uncertainty was calculated according to Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement (QUAM) 2000.The analytic characteristic of the reference methods was evaluated by human enzyme calibrators of Asahi Kasei Pharma corporation from Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards (JCCLS).

Results

The within-laboratory coefficient of variation ( CV) of the three enzymes was ranged from 1.5%-2.1% in the 2006 ring trials of RELA organized by IFCC and NCCL, while the within-laboratory CV of the three enzymes was less than 1.1% in the 2007 ring trials, and the bias(%) was less than that in 2006. The values were within the deviation acceptance range except for the values of three samples(7.99%,-7.02%,-13.97%). The within-laboratory CV of ALT, AST and LDH of the human enzyme calibrators of Asahi Kasei Pharma corporation were less than 1%, and the mean value deviation from target values was less than 1%.

Conclusions

The reference methods for the measurement of catalytic activity of ALT, AST and LDH have been improved and stable in our laboratory, and the results in the 2007 ring trials excelled those in the 2006 ring trials.

Keyword: Alanine aminotransferase; Aspartate aminotransferase; Lactate dehydrogenase; Reference method

为使血清酶定量(活性)测定的结果具有可比性, 2002~2006年国际临床化学联合会(IFCC)等不同的专业学会先后提出了酶活性定量测定的推荐方法, 到目前为止已发布了丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、γ -谷氨酰基转移酶(GGT)、淀粉酶(AMY)6个血清酶测定参考方法的标准操作规程(SOP)[1~6]。IFCC与德国临床化学协会(DGKL)于2003年开始针对参考实验室进行参考实验室室间质量评价(RELA), 每年进行1次。我国卫生部临床检验标准委员会(以下简称卫生部)也于2006年开始在中国酶学参考实验室间进行每年1次的酶学室间比对, 时间与IFCC参考实验室国际RFLA同时。本实验室于2006年度开始, 连续2年参加了IFCC的ALT、AST、LDH国际RELA及卫生部的酶学室间比对。我们分析了2年IFCC的国际RELA结果及卫生部酶学室间比对结果, 旨在评估本实验室所用的测定参考方法。

材料和方法
一、 材料

1.仪器与设备 日本岛津(SHIMADZU)UV-2550可见/紫外分光光度计; 日本东京理化EYELA循环水加热的NTT-2200比色杯温度控制装置, 温控精度是± 0.1 ℃, 无搅拌功能; ITS-90电子点温度计(美国Cole-parmer公司), 用于比色杯温度测定, 精度为± 0.01 ℃; AX205电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司), 精度为0.01 mg; Inlab413pH计(瑞士METTLER TOLEDO公司), 测定精度为± 0.001; reference移液器(德国Eppendorf公司); 移液管与用于定容的容量瓶均为德国SCHOTT公司生产。紫外分光光度计、电子点温度计、电子天平、pH计、移液器、移液管与容量瓶每年均由上海市计量院进行1次校准, 移液器由上海市计量院校准后送与生产厂家进行调整; 分光光度计与天平使用前均进行自检, pH计使用前进行3点校准。

2. 试剂 实验所用试剂原料(L-丙氨酸, 5'-磷酸吡哆醛, NADH, 乳酸脱氢酶, α -酮戊二酸, 天门冬氨酸, 苹果酸脱氢酶, NAD, NAD锂盐, 乳酸锂盐等) 购自美国sigma公司, 牛血清白蛋白为super-chem公司产品, 所有试剂均为分析纯。实验室用水为millipore超纯水(美国), pH值6.8~7.2。试剂配制根据IFCC公布的参考方法的SOP进行, 配制时温度控制在20~25 ℃。

3.样本 (1)IFCC参考实验室国际RELA样本:每次(2006年度与2007年度)为A、B 2个浓度的冻干粉, 保存于-20℃; (2)卫生部室间酶学室间比对样本:2006年度每个项目各为2个血清样本, 2007年度每个项目为2个血清样本与2个冻干粉, 样本运输到后保存于-80 ℃; (3)日本临床检验标准协议会(JCCLS)旭化成株式会社认证酶标准物质(JCERM):保存于2~8 ℃; (4)室内质控:使用Roche的cfas作为每天的室内质控。

二、 方法

1.样本测定程序 根据IFCC公布的ALT、AST、LDH的测定参考方法的SOP[2~4]进行。(1)国际RELA样本:每个项目每个浓度检测3 d, 每天测定10次, 每天复溶冻干粉一瓶, 共30次, 计算均值( x̅)与室内变异系数(CV), 并根据《分析测量中不确定度的量化》(QAUM2000)[7]计算不确定度; (2)卫生部酶学室间比对样本:每个项目每个浓度检测2 d, 每天测定5次, 共10次, 计算国际 x̅与室内CV; (3)JCEBM:操作同国际RELA样本。

2.不确定度的评估 由于酶学参考方法影响结果的因素很多, 我们上报DGKL 结果时对不确定度进行了初步评估。30次重复测定结果的s平均误差为A类标准不确定度; B类标准不确定度主要考虑了试剂的配制(称量、容量瓶定容、反应液pH调节)中产生的不确定度, 移液器、移液管吸取液体产生的不确定度以及紫外分光光度计校准的扩展不确定度; 试剂的配制、移液器、移液管吸取液体产生的不确定度考虑了校准与重复性因素。根据QAUM2000[7]计算合成标准不确定度。

3.结果分析 对2006年度与2007年度的国际RELA与卫生部酶学室间比对结果进行分析。JCERM于2007年度的DGKL与卫生部酶学室间比对之前进行检测。评估第1次国际RELA与卫生部酶学室间比对之后ALT、AST、LDH参考方法的分析性能(准确度与不精密度)。根据IFCC酶学参考方法的要求, 室内CV应低于1%。

结 果
一、 2006年度国际RELA结果与卫生部室间比对结果

1.对2006年度所有参加国际RELA的实验室的结果进行统计, 计算总体 x̅与扩展不确定度(eu)的均值及室间CV。本实验室2006年度国际RELA结果的室内CV均偏高(1.5%~2.1%), eu均较高, 有3个值的eu(样本A的ALT、AST, 样本B的AST)高于平均eu, 但这可能与有些实验室用2s代替了eu有关, x̅的偏倚均在给定的偏倚范围内, 见表1。

2.对2006年度所有参加卫生部酶学室间比对的实验室结果进行统计, 计算总体 x̅与室间CV。由于本次比对为卫生部酶学第1次室间比对, 参与实验室较少。可能由于长途运输血清样本的保存原因, 导致本实验室的结果出现较大偏倚, 尤其LDH两样本结果均严重偏低。室内CV与国际RELA结果均偏高(1.5%~2.0%), 见表2。

表1 2006年度国际RELA结果分析
表2 2006年度卫生部酶学室间比对结果分析
二、JCERM评估ALT、AST、LDH参考方法的分析性能(准确度与不精密度)

由2006年度国际RELA结果与卫生部酶学室间比对样本结果显示本实验室室内CV较高, 均达不到IFCC的标准(1%以下), 故对实验条件进行优化:操作人员操作稳定准确, 有效控制比色杯温度, 固定点温度计在比色杯中的位置, 保证各实验仪器设备的较好运行状态等。再进行分析性能评估。经过实验条件优化后, ALT、AST、LDH室内CV均能达1%以下, 且均值偏倚靶值均低于1%, 见表3。

表3 旭化成酶标准物质JCERM检测结果
三、2007年度国际RELA结果与卫生部酶学室间比对结果

1.2007年度本实验室的室内CV已较2006年度有了较大改变, 除AST(CV分别为1.12%、1.06%)外, ALT、LDH的室内CV均在1%以下, 且均值偏倚也整体低于2006年度的国际RELA结果, 见表4。

表4 2007年度国际RELA结果分析

2.本次室间质评参与实验室较2006年度有所增加, 但室间CV要略高于2007年度RELA的室间CV, 样本2的LDH由于出现了一个极低值, 导致室间有12.00%的变异。本实验室2007年度的室内CV有了较大改变, 所测项目CV均在1%以下, 除样本1的ALT与样本4的AST均值偏倚稍高外(但在允许偏倚范围内), 其余均较低, 见表5。

表5 2007年度卫生部酶学室间比对结果分析
讨 论

本实验室自2005年建立, 2006年正式启用, 初期建立了ALT、AST、LDH 3个血清酶的参考方法。本实验室是我国为数不多的连续2年参加了国际RELA与卫生部酶学室间比对的实验室。由于实验室2006年刚启用, 所以在进行2006年度的国际RELA与卫生部酶学室间比对时, 实验室条件并不太成熟, 实验操作人员对实验条件控制不够精准平稳、比色杯内的温度控制不太稳定、手工搅拌不够均匀等因素导致了结果的室内CV较大, 均不能低于1%。由于2006年度酶学室间比对为卫生部酶学第1次比对, 参与实验室较少。可能由于长途运输血清样本的保存原因, 导致本实验室的结果出现较大偏倚, 尤其LDH两样本结果均严重偏低。在2006年度的国际RELA与卫生部酶学室间质评之后, 对实验条件进行了优化。实验操作人员的精准稳定操作最为重要, 所以实验操作应由固定人员进行, 精确加样与冻干品复溶的严格控制都是保证结果准确度、精密度的重要前提, 冻干品的程序在文献[8]中有详细描述。初期时所用水为国产去离子制水仪制作的去离子水再进行双蒸后过滤, 后发现所用去离子水的pH值为5~6, 改用美国Millipore直接产的超纯水(pH值为6.8~7.2), 可以更好的控制反应pH值; 比色杯内的点温度计的温度测试固定在一个位置, 控制稳定在一个稳定状态; 比色杯内液体混匀搅拌的频率与次数保持一致; 移液器、移液管、容量品在比对前进行严格校准; 其余仪器(分光光度计、pH计、电子天平)在比对前也经上海市计量院校准; 检测时房间内温度保持恒定(22~25 ℃)。此外, 本实验室进行卫生部酶学室间比对时, 由于血清样本要从北京运送到上海, 所以血清样本的运送保存很重要, 一般使用干冰运输, 运送到后立即置于-80 ℃冰箱中, 防止样本酶活性降低。

在一系列的条件优化后, 在2007年度的国际RELA与卫生部酶学室间比对之前, 使用JCERM对实验室ALT、AST、LDH的参考方法进行了评估, 结果显示经过实验条件优化后, ALT、AST、LDH室内CV均在1%以下, 且 x̅均在允许偏倚范围内, 并整体低于2006年度, 表明实验室参考方法检测ALT、AST、LDH的条件已逐渐成熟稳定。2007年度的国际RELA与卫生部酶学室间比对结果也显示了本实验室ALT、AST、LDH室内CV均在1%以下, 也有较好准确度。这3个血清酶的参考方法已比较成熟稳定, 为进一步建立其他3种酶(CK、GGT 、AMY)的参考方法提供条件与可能。

不确定度的初步评估主要包括:重复测定结果的s平均误差为A类标准不确定度; B类标准不确定度主要考虑了试剂的配制(称量、容量瓶定容、反应液pH调节)中产生的不确定度, 移液器、移液管吸取液体产生的不确定度以及紫外分光光度计校准的不确定度; 试剂的配制、移液器、移液管吸取液体产生的不确定度考虑了校准与重复性因素, 根据QAUM2000计算合成标准不确定度。但由于检测过程中影响分量太多且不易评价, 如稳定的影响、pH值的影响、分光光度计稳定性影响、实际消光系数与理论值的偏差、环境条件的影响等均无法简单评价, 故eu的评价需要进一步分析。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. Part 2. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of creatine kinase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(6): 635-642. [本文引用:1]
[2] Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. Part 3. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(6): 643-648. [本文引用:1]
[3] Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Part 4. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine aminotrasferase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(7): 718-724. [本文引用:1]
[4] Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Part 5. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of aspartate aminotransferase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(7): 725-733. [本文引用:1]
[5] Schumann G, Bonora R, Ceriotti F, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C. International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Part 6. Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of gamma-glutamyltransferase[J]. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(7): 734-738. [本文引用:1]
[6] International Federation of Clinical Chemistry and La-boratory Medicine (IFCC), Schumann G, Aoki R, et al. IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C[J]. Clin Chem Lab Med, 2006, 44(9): 1146-1155. [本文引用:1]
[7] EURACHEM/CITAC. Quantifying uncertainty in an-alytical measurement[S]. 2nd ed. 2000: 4-31. [本文引用:2]
[8] 王涛, 齐丽丽, 刘海燕, 等. 六种临床诊断酶学测定参考方法的应用及国际比对结果分析[J]. 中华检验医学杂志, 2008, 31(3): 264-269. [本文引用:1]