引用本文
周火根, 池妤. 机采血小板细菌16s rRNA基因检测的临床研究. 2009, 24(10): 724-726
ZHOU Huogen, CHI Yu. Clinical study of bacterial 16s rRNA gene detection in apheresis platelets. Labratory Medicine, 2009, 24(10): 724-726  
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《检验医学》编辑部
机采血小板细菌16s rRNA基因检测的临床研究
周火根1, 池妤2
1. 浙江省永康卫生学校,浙江 永康 321300
2. 永康市第一人民医院,浙江 永康 321300

作者简介:周火根,1961年生,本科,副主任技师,主要从事医学检验及教学管理工作。

摘要
目的

探讨快速、可靠的检测机采血小板(PLT)细菌污染的新方法。

方法

用聚合酶链反应(PCR)扩增1 308份献血员机采PLT 16s rRNA基因,以乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV DNA)、白假丝酵母菌和人类基因组DNA为对照,检测该方法的特异性;采用10倍倍比稀释法进行该方法的敏感性检测。

结果

检测1 308份献血员机采PLT,其中7份16s rRNA基因为阳性,阳性率为0. 54%(7/1 308)。而与HBV DNA、白假丝酵母菌和人基因组DNA无交叉反应;PCR最低能检测1.5×104 cfu/L大肠埃希菌。

结论

献血员机采PLT板细菌污染的阳性率为0.54%;利用PCR检测献血员机采PLT细菌16s rRNA基因的方法具有特异性、快速性和敏感性高等特点。

关键词: 机采血小板; 16s rRNA基因; 细菌; 聚合酶链反应
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)010-0724-03
Clinical study of bacterial 16s rRNA gene detection in apheresis platelets
ZHOU Huogen1, CHI Yu2
1. Zhejiang Yongkang Health School, Zhejiang Yongkang 321300,China
2.Yongkang First People's Hospital,Zhejiang Yongkang 321300,China
Abstract
Objective

To explore a rapid and reliable method for the detection of bacterial contamination in the apheresis platelets.

Methods

The fragment of bacterial 16s rRNA gene,taken from apheresis platelets of 1 308 blood donors,was amplified by polymerase chain reaction(PCR).Using HBV DNA, Candida albicans and human genome DNA as controls,the specificity was tested.The sensitivity test was performed by the method of 10 gradual dilution.

Results

7 of 1 308 alpheresis platelets samples showed 16s rRNA gene positive and the bacterial contamination ratio of apheresis platelets was 0.54%. The cross-reaction with the HBV DNA, Candida albicans and human genome DNA was negative. PCR exhibited sensitivity as low as 1.5×104 cfu/L Escherichia coli.

Conclusions

The bacterial detection method of 16s rRNA gene offers the adventages of high specificity, sensitivity and rapidity.

Keyword: Apheresis platelet; 16s rRNA gene; Bacteria; Polymerase chain reaction

输注细菌污染的血小板(PLT)会导致严重的败血症, 甚至死亡, 在输血医学界已引起重要的关注。近几年, 输血相关细菌污染率保持在相对恒定状态[1]。随着血液成分技术的发展, PLT输注数量增加, 降低输血引起的细菌污染越来越受到挑战。长期以来, 实验室检测PLT细菌污染常用方法耗时长, 且阳性率低。近年来, 随着分子生物学技术的快速发展, 并已成为生物医学领域最具有价值的诊断和研究手段之一。因原核微生物均有16s rRNA基因, 且16s rRNA基因有高度保守序列, 其在细菌鉴定中具有重要意义。因此选择16s rRNA基因保守区共同引物, 获取可变区特异性片段, 利用16s rRNA聚合酶链反应(PCR)扩增方法为检测PLT细菌污染具有快速、敏感、准确等特点。有利于临床的输血安全, 也为采、供血机构和医疗机构的血液质量管理提供科学依据。

材料和方法
一、材料

1. 标本来源 收集1 308份献血员机采PLT均来源于浙江金华市中心血站2006年3月至2007年12月, 低温保存于无菌试管中。

2. 菌株 菌株来源于2007年9月至2007年12月浙江永康市第一人民医院微生物实验室保存的常见引起败血症的菌株10株, 包括:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、溶血性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌及枯草杆菌及白假丝酵母菌。乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV-DNA)和人类基因组DNA由浙江省临床检验中心提供。

3. 对照组 同时用30名正常人血标本做质控。

二、方法

1. 16s rRNA基因序列 上游为5' -TCAAAG-GAATTGACGGGGGC-3'; 下游为5' -AGGCCCGG-GAACGTATTCAC-3', 扩增产物长度为475 bp(由上海生物工程公司提供)。

2. PLT中细菌的模板DNA 取样2.0 mL于无菌的试管中, 高速12 000 r/min(离心半径8.5 cm)离心10 min, 取沉淀物约100 μ L。加无菌0.9%NaCl溶液1.0 mL, 取沉淀物同上离心, 去上清液并重复一次, 最后取沉淀物于TE液中约50 μ L。用Genelute maxiprep复合柱子对核酸提取试剂盒反应进行过滤, 再按核酸提取试剂说明提取细菌DNA基因.并用sau3AI对PCR反应体系进行消化以避免假阳性的产生。即在PCR扩增前将双蒸水、缓冲液、MgCl2和Taq酶混合后, 用1.0U的Sau3AⅠ 在37 ℃作用30 min, 然后95 ℃灭活, 可将Taq酶中污染的DNA去除。

3. PCR试剂盒 按购自宝生物(大连)生物工程公司说明配制反应体系, 总体积为50 μ L。包括:25 mmol/L MgCl2 4 μ L, 2.5 mmol/L dNTPs 4μ L, 10× Buffer 5 μ L, 20 μ mol/L引物各1 μ L, 5 U/μ L Taq酶0.25 μ L, 模板5.0 μ L, 加无菌双蒸水至50 μ L。在9600型PCR反应仪(购于美国Perkin elmer公司)进行扩增。 取DNA Marker DL-2000[购自宝生物(大连)生物工程公司]、扩增产物10 μ L与1 μ L上样缓冲液混匀后, 加样于1.3%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭), 100 V电压, 电泳30 min, 将电泳后的琼脂糖凝胶置于(美国BIO-RAD公司的产品)Gel doc 1000型凝胶图象处理系统分析。

4. 阴性对照 对以上试验同时用无菌双蒸馏水做阴性对照。

结 果
一、PCR扩增结果

被检测的10株细菌进行PCR扩增后, 均获得阳性条带, 与DNA Marker DL-2000相对照, 其扩增产物长度为475bp。而对照组的HBV-DNA、白假丝酵母菌和人类基因组DNA无相应条带。

二、PCR敏感性检测

用无菌双蒸馏水按10倍倍比稀释法将大肠埃希菌悬液依次稀释成1.5× 109cfu/L、1.5× 108cfu /L、1.5× 107cfu /L、1.5× 106cfu /L、1.5× 105cfu /L、1.5× 104cfu /L、1.5× 103cfu /L、1.5× 102cfu /L、1.5× 101cfu /L, 然后分别提取其DNA进行PCR扩增, 电泳后在1.5× 109 cfu /L ~1.5× 104 cfu /L之间均有条带, 其后面继续稀释的无相应条带, 表明PCR可检测范围低至1.5× 104 cfu /L, 见图1。

图1 大肠埃希菌10倍倍比稀释电泳图谱注:M为DNA Marker DL-2000; 1为大肠埃希菌1.5× 109cfu/L; 2为1.5× 108cfu/L; 3为1.5× 107cfu/L; 4为1.5× 106cfu/L; 5为1.5× 105cfu/L; 6为1.5× 104cfu/L; 7~10为< 1.5× 104cfu/L; 11为空白对照

三、1 308份献血员机采PLT

30名正常对照者的血液检测结果, 见表1。

表1 1 308份献血员机采PLT及正常对照者16s rRNA基因检测结果
讨 论

输注献血员机采PLT在临床治疗工作中已被广泛应用。但相关的PLT细菌污染问题至今尚未解决, 仍是输血感染致病和死亡的主要原因。

PLT细菌高污染率与PLT 20~24 ℃严格的的保存温度、保存湿度和丰富营养有很大关系。PLT污染的细菌, 根据来源, 可分为内源性和外源性。外源性细菌污染有采血器材、献血员皮肤、采血者双手消毒不彻底、空气中细菌超标、PLT储存与制备过程、血袋被污染、血袋破损等情况; 内源性的细菌污染则来自献血员无症状或低水平菌血症。 研究发现表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、克雷伯氏杆菌、沙雷氏菌、沙门菌、假单胞菌、大肠杆菌是主要的污染PLT的细菌, 其中表皮葡萄球菌和大肠杆菌最常见[2] 。这些细菌大多来自献血员皮肤表面菌群。

原核生物中, 基因位点(rrn)包括5s rRNA 、16s rRNA、23s rRNA 3个基因, 其中16s rRNA基因分子量为2.9拷贝, 由1 540个核苷酸组成, 一个细菌中可含16s rRNA基因5~10个拷贝, 支原体、衣原体、立克次体和螺旋体也存在16s rRNA, 病毒、真核生物都不具有此基因。该基因内部结构由保守区与可变区交叉排列组成, 保守序列在所有细菌高度一致, 而可变区则随菌种不同有较大变化。因此16s rRNA被广泛用于细菌鉴定。随着分子学技术的发展, 16s rRNA将为体外不容易培养的细菌鉴定提供很大的帮助。

目前, 检测PLT细菌污染的方法众多, 但都存在敏感性低、特异性差等问题。近几年发展起来的自动化细菌培养系统, 取样量大约(10 mL); 检测时间长, 易受细菌种类、数量、临床上是否使用抗生素等因素的影响; 且造价高, 需较好的后勤保障, 并存在一定假阳性, 须附加其他检测措施。虽是目前的细菌检测的金标准, 但敏感性不高[3]。刘赴平等[4]对786份机采PLT做细菌培养, 阳性率为0.38%(3/786), 国外文献报道为1/5 000-1/6 000[5]。 尽管用细菌培养系统对PLT进行筛选, 荷兰西南地区血液监测办公室仍然收到了2例因输注芽孢杆菌的PLT制品发生危险生命脓毒血症的报道[6]。1998~2000年, 美国疾控中心, 美国输血协会, 美国红十字会和美国国防部进行了一项PLT细菌污染的研究, 单采PLT输血感染败血症的发生率是9.98/100万U, 致死率为2.22/100万U[7]。本实验采用PCR技术检测了1 308份献血员机采PLT中的16s rRNA基因, 阳性为7 份, 阳性率为 0.54 %(7/1 308), 明显高于细菌培养法, 但与有关文献报道0.83%[8]有一定的差异, 这可能由于本地区对献血员筛选、消毒措施、采血术、保存制备、检测前病原体灭活程度与方法等一整套措施制度较严格、规范和完善, 且极少在流动车采集PLT等有关。本实验说明目前临床使用的PLT存在一定程度的细菌污染率, 在一定程度上影响临床的输血安全。如何最大限度降低PLT的细菌污染, 确保临床的输血安全应引起输血工作者的高度重视。

本实验结果显示该方法具有很好的敏感性和特异性, 检出限为1.5× 104 cfu/L, 且不受细菌种类、血液中抗生素或血清抑制剂的影响, 克服了细菌生长缓慢所带来的问题; 且快速, 可在4 h内完成整个检测过程; 并可进行批量检测。但也存在一定缺点, 如无法区分活菌和死菌; 不能对菌种进行分离鉴定; 也存在一定的假阳性等。本实验采用分子生物学技术检测PLT中细菌的16s rRNA基因的方法对保证临床PLT的输注安全有很重要的意义, 值得推广。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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