引用本文
赵虎, 涂婉, 蒙杰, 唐轩. 医院感染中革兰阴性杆菌AmpC β-内酰胺酶产酶率分析. 2009, 24(10): 721-723
ZHAO Hu, TU Wan, MENG Jie, TANG Xuan. Analysis of AmpC β-lactamase productive rate in the Gram-negative bacilli from nosocomial infection. Labratory Medicine, 2009, 24(10): 721-723  
Permissions
Copyright©2009, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
医院感染中革兰阴性杆菌AmpC β-内酰胺酶产酶率分析
赵虎1, 涂婉1, 蒙杰2, 唐轩2
1.复旦大学附属华东医院检验科,上海 200040
2.南通医学院检验系,江苏 南通 226007

作者简介:赵 虎,男,1962年生,博士,主任技师,主要从事临床微生物学研究。

基金:上海市科委重点科研基金资助项目(054119509)
摘要
目的

了解华东医院的医院感染病原菌中革兰阴性杆菌产AmpC β-内酰胺酶的情况。

方法

用改良的头孢西丁三维试验检测持续高产AmpC β-内酰胺酶。

结果

华东医院的医院感染病原菌中革兰阴性杆菌产持续高产AmpC β-内酰胺酶的产酶率为7.20%,其中阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌和黏质沙雷菌产酶率高,分别为36.85%、33.34%和33.34%。

结论

华东医院的医院感染菌株产酶率较高,应引起临床高度重视。

关键词: AmpC β-内酰胺酶; 医院感染; 革兰阴性杆菌; 三维试验
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2009)10-0721-03
Analysis of AmpC β-lactamase productive rate in the Gram-negative bacilli from nosocomial infection
ZHAO Hu1, TU Wan1, MENG Jie2, TANG Xuan2
1.Department of Clinical Laboratory, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
2.Department of Medical Laboratory, Nantong Medical College, Jiangsu Nantong 226007, China
Abstract
Objective

To investigate the productive rate of AmpC β-lactamases in the Gram-negative bacilli from the nosocomial infection in Huadong hospital.

Methods

Durative high expressed AmpC β-lactamases were detected by the improved cefotaxime three-dimensional test.

Results

The productive rate of the durative high expressed AmpC β-lactamases was 7.20%. In this determination, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii and Serratia marcescens were easy to produce the enzymes, and the productive rates were 36.85%, 33.34% and 33.34% respectively.

Conclusions

The productive rate of AmpC β-lactamases in the Gram-negative bacilli from the nosocomial infection is rather high, which should be attached great importance to clinic.

Keyword: AmpC β-lactamase; Nosocomial infection; Gram-negative bacilli; Three-dimensional test

近年来随着β -内酰胺类抗菌药物的广泛应用, 细菌产各种β -内酰胺酶导致的耐药现象日趋严重。其中产AmpC β -内酰胺酶(简称Amp C酶)的革兰阴性细菌日益增多, 尤其是产持续高产AmpC酶的菌株增多, 已造成临床抗感染治疗的困难, 应高度重视。本研究采用改良的头孢西丁三维试验, 检测和分析2006至2007年华东医院的医院感染患者临床标本中分离出的革兰阴性杆菌产持续高产AmpC酶的阳性检出率, 以了解华东医院的医院感染菌株的产酶情况。

材料和方法
一、标本选择

2006年1月至2007年12月华东医院符合医院感染标准[1]的患者送检各类细菌标本824例(同一患者同一部位取第1次送检标本, 痰和咽拭同时送检仅取其一, 以阳性者统计; 同一患者不同部位分别统计)。

二、细菌分离鉴定

按照常规方法培养细菌[2]。血平板、巧克力平板和麦康凯平板由法国生物梅里埃公司提供。沙门菌属-志贺菌属(SS)平板和硫代硫酶钠枸橼酸钠胆盐蔗糖(TCBS)平板由上海伊华医学科技有限公司提供。用VITEK-AMS(法国生物梅里埃公司)进行菌种鉴定。

三、产AmpC 酶菌株的筛选

从临床标本中分离的各种革兰阴性细菌, 用VITEK-AMS进行细菌体外药敏试验。头孢西丁(FOX)耐药[最低抑菌浓度(MIC)> 32 μ g/mL], 为产AmpC 酶拟似菌株。

四、酶粗提物制备

将FOX耐药菌株(产AmpC酶拟似菌株)转种水解酪蛋白胨(MH)平板(法国生物梅里埃公司), 35 ℃孵育18~24 h, 挑取菌落接种30 mL胰酶消化大豆肉汤中, 35 ℃孵育12~16 h, 以4 000 r/min(离心半径为10 cm)离心30 min, 弃上清液, 沉淀物加入0.06 mol/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)200 μ L, 混匀后-80 ℃和37 ℃各30 min 反复冻融6次。10 000 r/min(离心半径为10 cm) 4 ℃离心30 min, 上清液经过滤膜孔径为0.22 μ m的细菌滤器过滤, 滤液即为酶粗提液。取滤液接种MH平板, 常规细菌培养阴性者置-20 ℃冻存。

五、改良的FOX三维试验

将0.5麦氏单位大肠埃希菌(ATCC 25922)均匀涂布在MH平板上, 取FOX纸片(30 μ g)置平皿中央, 在距纸片5 mm处对称打孔, 用微量加样器在一孔中加入酶粗提物60 μ L, 另一孔中加入酶粗提物50 μ L和氯唑西林(CLO)10 μ L(20 mmol), 35 ℃孵育18~24 h, 观察结果。用阴沟肠杆菌(029M)为阳性对照, 阴沟肠杆菌(029, 野生型)为阴性对照。结果判断标准:加酶粗提物的孔与抑菌圈交界处出现扩大的生长区, 而加酶粗提物和CLO混合液的孔与抑菌圈交界处未出现扩大的细菌生长区, 为FOX三维试验阳性, 提示产持续高产AmpC 酶; 若2个孔均未出现扩大的细菌生长区, 则为FOX三维试验阴性, 提示不产持续高产AmpC 酶[3]。

结 果
一、医院感染病原菌中革兰阴性细菌的种类和分布

送检各种细菌标本824例, 其中433例标本阳性。检出病原菌495株(同一患者不同部位同时分离出细菌分别统计, 如15例患者同时从痰和中段尿或血中分离出细菌, 统计为30株。另外, 39例标本检出2种病原菌, 4例标本检出3种病原菌), 以铜绿假单胞菌最为多见, 其次为大肠埃希菌和嗜麦芽窄食单胞菌。细菌的种类和分布见表1。

二、FOX三维试验

431株革兰阴性杆菌, FOX初筛阳性124株。FOX三维试验阳性31株, 阳性检出率为7.20%。见表2。

表1 医院感染的细菌种类和分布
表2 医院感染菌株AmpC酶的阳性检出率
讨 论

革兰阴性杆菌是目前医院感染最常见的病原菌。华东医院的医院感染病原菌也以铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等革兰阴性杆菌最为多见。

革兰阴性杆菌的耐药性不断上升, 其最主要的耐药机制是产生各种耐药酶, 其中以超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶为主。

AmpC酶是一类β -内酰胺酶, 由肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌的染色体或质粒介导产生, 主要作用于头孢菌素类抗菌药物, 且不能被克拉维酸所抑制, 故又称头孢菌素酶[3~5]。

根据其产酶的类型, AmpC酶分为诱导酶和非诱导酶, 诱导酶即细菌在β -内酰胺类抗菌药物的诱导下产生的AmpC酶; 非诱导酶是指产酶基因、尤其是ampD发生去阻遏突变而产生的持续高产AmpC酶(低产AmpC酶因酶的含量少, 不易检出), 或由质粒介导产生的AmpC酶。其特征是不需诱导剂的存在, 细菌死亡、裂解后仍能检出。非诱导酶中的持续高产AmpC酶产酶量高、水解作用强, 是临床检测的主要类型[6, 7]。

检测持续高产非诱导酶采用FOX三维试验, 其利用AmpC酶可以抑制FOX的原理, 先用冻融法或超声粉碎法将待检菌株中的AmpC酶提取出来(粗提), 观察这种酶的粗提物对FOX的抑制情况。如果粗提物中有AmpC酶存在, 可以抑制FOX的活性, 使其周围对FOX敏感的大肠埃希菌得以生长(扩大的生长区); 而CLO可以抑制AmpC酶的活性, 在加入CLO后则不出现扩大的生长区。如果没有AmpC酶存在, 大肠埃希菌受FOX的抑制则不能生长[8, 9]。

在检测的431株革兰阴性杆菌中, FOX三维试验阳性菌株共31株, AmpC酶产酶率为7.20%, 其中阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌和黏质沙雷菌产酶率高, 分别为36.85%、33.34%和33.34%; 嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产酶率相对较低, 分别为0.00%、0.96%和2.71%。

统计数据表明, 华东医院的医院感染病原菌产持续高产AmpC酶较高, 尤其以阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌和黏质沙雷菌产酶率高。这些细菌引起的医院感染, 因产持续高产AmpC酶, 对β -内酰胺类抗菌药物, 包括青霉素类, Ⅰ 代、Ⅱ 代和部分Ⅲ 代头孢菌素类抗菌药物耐药, 导致临床抗感染治疗困难, 应引起临床高度重视。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 中华人民共和国卫生部办公厅. 医院感染诊断标准(试行)[S]. 国卫生部办公厅, 2001. [本文引用:1]
[2] 叶应妩, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 第3版. 南京: 东南大学出版社, 2006: 736-870. [本文引用:1]
[3] 段金菊, 刘卓拉, 张润梅, 等. 三维实验对产AmpC酶革兰阴性菌的检测及分析[J]. 中国药物与临床, 2007, 7(4): 257-260. [本文引用:2]
[4] Mammeri H, Eb F, Berkani A, et al. Molecular cha-racterization of AmpC-producing Escherichia coli clinical isolates recovered in a French hospital[J]. J Antimicrob Chemother, 2008, 61(3): 498-503. [本文引用:1]
[5] 赵虎, 周庭银, 孔宪涛. AmpC β-内酰胺酶及其分子生物学检测[J]. 中国感染控制杂志, 2005, 4(4): 377-380. [本文引用:1]
[6] Maveyraud L, Pratt RF, Samama JP, et al. Crystal structure of an acylation transition-state analog of the TEM-1 beta-lactamase. Mechanistic implications for class A beta-lactamases[J]. Biochemistry, 1998, 37(8): 2622-2628. [本文引用:1]
[7] Pfaller MA, Jones RN, Marshall SA, et al. Inducible AmpC beta-lactamase producing Gram-negative bacilli from blood stream infections: frequency, antimicrobial susceptibility, and molecular epidemiology in a national surveillance program(SCOPE)[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 1997, 28(4): 211-219. [本文引用:1]
[8] 张磊, 李萍, 冯萍. 医院感染高产AmpC β-内酰胺酶阴沟肠杆菌的分子流行病学研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2001, 11(4): 254-257. [本文引用:1]
[9] 赵虎, 孔宪涛. AmpC β-内酰胺酶的检测[J]. 中华检验医学杂志, 2003, 26(6): 390-392. [本文引用:1]